漲知識(shí)|qPCR專(zhuān)場(chǎng)六：一文讀懂qPCR文章金標(biāo)準(zhǔn)-MIQE
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實(shí)驗(yàn)，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生巔峰呢？
2009年，Stephen A等人發(fā)表文章《The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments》，這是一群qPCR大牛經(jīng)過(guò)商討制定的qPCR實(shí)驗(yàn)和發(fā)表文章指南，其目的是為了作者根據(jù)指南提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，審稿人據(jù)此可以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)所用方法的可靠性，其他研究人員也可以利用這些信息進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
MIQE指南由9個(gè)部分組成，共涉及85個(gè)參數(shù)，以保證qPCR實(shí)驗(yàn)的實(shí)用性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。這9 部分包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、靶標(biāo)基因、qPCR引物和探針、qPCR實(shí)驗(yàn)報(bào)告、qPCR合理性和數(shù)據(jù)分析。85個(gè)參數(shù)針對(duì)qPCR結(jié)果的重要性，分為了兩類(lèi)：其中標(biāo)記為“E”表示必須(essential)，標(biāo)記為“D”表示建議(desirable)。
針對(duì)提取得到的RNA等核酸進(jìn)行量化十分重要，尤其是在比較分析不同樣本時(shí)，RNA等核酸投入一致或類(lèi)似的數(shù)量能夠避免一系列不確定因素。另外RNA等核酸的質(zhì)量評(píng)估也必不可少。常見(jiàn)的量化和質(zhì)量評(píng)估方法有多種，最為常見(jiàn)的是分光光度法，但需要注意的是A260/A280比值必須在中性PH值buffer中進(jìn)行測(cè)量，吸光度比值會(huì)受到DNA或者殘余苯酚的影響而改變且不能評(píng)估核酸是否發(fā)生降解，故最好搭配其他檢測(cè)方法，例如瓊脂糖凝膠電泳、或者是參考基因/靶基因3‘：5’完整性檢測(cè)。如果RNA樣本部分降解，該信息在發(fā)表文章時(shí)需要告知，因?yàn)榈退睫D(zhuǎn)錄檢測(cè)的敏感性可能降低，其中降解帶來(lái)的差異可能會(huì)造成不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。
RNA提取過(guò)程中也應(yīng)包括DNA酶處理步驟，用以去除相關(guān)的基因組DNA污染。建議對(duì)RNA樣本是否經(jīng)過(guò)DNA酶處理(包括DNase類(lèi)型和反應(yīng)條件)等做好記錄。
核酸中雜質(zhì)殘留的檢測(cè)應(yīng)通過(guò)稀釋樣本做反轉(zhuǎn)錄以檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄活性或PCR抑制程度，或者采用SPUD等抑制實(shí)驗(yàn)。
核酸的結(jié)構(gòu)(例如莖環(huán)二級(jí)RNA結(jié)構(gòu))對(duì)于反轉(zhuǎn)錄和PCR的效率有著重要的影響。故而引物、探針和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的位點(diǎn)需考慮到RNA的折疊。
引物的特異性需用直接的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證有效性，例如凝膠電泳、熔解曲線(xiàn)、DNA測(cè)序、擴(kuò)增子大小、和/或限制性酶切驗(yàn)證。一些引物優(yōu)化的證據(jù)或方案最好也可提供，理想的形式是退火溫度梯度或Mg2+濃度梯度摸索并以Cq值、熒光與循環(huán)曲線(xiàn)圖的形式呈現(xiàn)數(shù)量和/或熔解曲線(xiàn)。
所有qPCR反應(yīng)都需要進(jìn)行額外的質(zhì)控或定量標(biāo)準(zhǔn)品，例如使用NTC檢測(cè)PCR污染。每96孔板或每批樣品上樣應(yīng)包括NTC，并確定數(shù)據(jù)不符合的條件，舉個(gè)例子，如果未知最低濃度的Cq值為35，則可以忽略Cq值≥40的NTC。
4.1擴(kuò)增效率
穩(wěn)定和精確的熒光定量PCR檢測(cè)通常和高效的擴(kuò)增效率相關(guān)。尤其當(dāng)檢測(cè)經(jīng)內(nèi)參基因校準(zhǔn)的目的基因mRNA濃度時(shí)，擴(kuò)增效率尤為重要。△△Cq法是測(cè)定樣品間不同基因表達(dá)情況最常用的方法之一，是基于單個(gè)內(nèi)參基因的校準(zhǔn)進(jìn)行的。計(jì)算靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因的Cq值的差異，并直接比較不同樣本之間的△Cq，這種情況需要兩個(gè)基因能以可比的效率進(jìn)行擴(kuò)增，方能進(jìn)行比較。
擴(kuò)增效率必須通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)確定，因?yàn)檫@種校準(zhǔn)方法提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速以及可重復(fù)擴(kuò)增效率、分析敏感性和實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的平均指標(biāo)。擴(kuò)增效率根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)數(shù)線(xiàn)性部分的斜率確定。每個(gè)靶標(biāo)基因的的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)需提交在稿件中，這樣審稿人能夠看到。
4.2線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍
根據(jù)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的模板，動(dòng)態(tài)范圍應(yīng)至少包括3個(gè)數(shù)量級(jí)，理想狀態(tài)是5或6 Log10濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性區(qū)間需包括被定量的靶標(biāo)基因的區(qū)間。由于定量下限通常定義不明確，應(yīng)當(dāng)確定線(xiàn)性區(qū)間內(nèi)最低濃度的變化。同時(shí)需要展示相關(guān)系數(shù)(R2 值)
4.3靈敏度(LOD)
LOD的定義是可以檢測(cè)到95%的陽(yáng)性樣品的最低濃度。換言之，在一組含有目的基因的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，在LOD濃度下，不應(yīng)發(fā)生超過(guò)5%的失敗反應(yīng)。實(shí)際上，我們可以通過(guò)有限稀釋法來(lái)檢測(cè)，失敗和成功反應(yīng)的百分比覆蓋泊松分布即可。
4.4精度
熒光定量PCR結(jié)果的變化有多種原因，包括溫度的差異可影響退火或變性，移液誤差引起的濃度差異和隨機(jī)變化。qPCR精度和濃度相關(guān)，一般隨著拷貝數(shù)的降低而降低。理想情況下，實(shí)驗(yàn)內(nèi)的重復(fù)性應(yīng)當(dāng)以SD error bar或具有重復(fù)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上的CIs的形式顯示在圖中。CVs不應(yīng)與Cqs一起使用，但可用于表達(dá)拷貝數(shù)或濃度的差異。
多重實(shí)驗(yàn)大大擴(kuò)展了qPCR分析的能力，特別是應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)點(diǎn)突變或多態(tài)性檢測(cè)。多重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)需要證明多個(gè)靶標(biāo)的準(zhǔn)確量化在同一管中不會(huì)受到干擾，即，擴(kuò)增效率和靈敏度和進(jìn)行單重實(shí)驗(yàn)時(shí)是一致的。這點(diǎn)當(dāng)豐度較低的靶標(biāo)基因和豐度高的靶標(biāo)基因進(jìn)行共同擴(kuò)增時(shí)尤為重要。
數(shù)據(jù)分析包括對(duì)原始數(shù)據(jù)的檢查、對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量和可靠性的評(píng)估，以及生成可報(bào)告的結(jié)果。
均一化是進(jìn)行科學(xué)qPCR分析的一個(gè)重要組成部分，該過(guò)程控制核酸抽提效率、反轉(zhuǎn)錄效率和擴(kuò)增效率的變化，從而能夠比較不同樣本的RNA濃度。使用內(nèi)參基因作為內(nèi)部對(duì)照是最常見(jiàn)的均一化RNA數(shù)據(jù)的方法。均一化包括靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因的RNA濃度之比。內(nèi)參基因的RNA應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)，其基因豐度與樣品中mRNA總量呈現(xiàn)強(qiáng)相關(guān)。
均一化通常不能用一個(gè)內(nèi)參基因，除非作者可為審稿人提供明確的證據(jù)證實(shí)內(nèi)參基因在其實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)恒定。內(nèi)參基因的最佳數(shù)目和選擇需通過(guò)文章具體實(shí)驗(yàn)確定并報(bào)告方法。
生物體本身固有的變異性可能與組間的實(shí)驗(yàn)差異相匹敵，甚至超過(guò)后者。尤其是使用許多生物學(xué)重復(fù)來(lái)提高實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)重要性時(shí)，這種變化就變得顯而易見(jiàn)。雖然生物重復(fù)間的差異可能很大，但是足夠數(shù)量的樣本可以減少實(shí)驗(yàn)差異性。許多因素會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)變異，從而影響到達(dá)統(tǒng)計(jì)所需的生物重復(fù)的數(shù)量。因此，功效分析(power analysis)有助于確定有效可靠結(jié)論所需的樣本數(shù)。
使用PCR僅檢測(cè)核酸是否存在，而不是對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量，被稱(chēng)為定性PCR，該方式廣泛應(yīng)用于病原體診斷。PCR方法定性/定量分層問(wèn)題在于，準(zhǔn)確回答是或否，需要低敏感性PCR實(shí)驗(yàn)的敏感性信息。因此，即使是定性分析也應(yīng)提供有關(guān)分析能力的相關(guān)信息。
建議將縮寫(xiě)qPCR用于real-time PCR，并將RT-qPCR用于反轉(zhuǎn)錄-qPCR。將RT-PCR簡(jiǎn)稱(chēng)為qPCR會(huì)引起混淆，并且與傳統(tǒng)RT-PCR的應(yīng)用不符。
內(nèi)參基因
內(nèi)參基因應(yīng)當(dāng)指的是參照基因(reference genes)，而不是管家基因(housekeeping genes)。
TaqMan探針應(yīng)指為水解探針(hydrolysis probes)。
FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針)指的是一種機(jī)制，指發(fā)射/猝滅依賴(lài)于兩個(gè)熒光染料分子的電子激發(fā)態(tài)之間相互作用。LightCycler型探針指的是雙雜交探針(dual hybridization probes) 。
牛津英語(yǔ)詞典只列出了定量(quantification)，非定量(non-quantification)，因quantification是恰當(dāng)?shù)?，而不是quantitation。
現(xiàn)在文獻(xiàn)中使用的閾值循環(huán)(threshold cycle, Ct)，交點(diǎn)(crossing point, Cp)和分支點(diǎn)(take-off point, TOP) 與PCR循環(huán)的術(shù)語(yǔ)不一致。這些術(shù)語(yǔ)指的實(shí)際上是相同的值，只是由于不同儀器廠家由于產(chǎn)品差異化的原因造成的，不具有科學(xué)的準(zhǔn)確性和清晰性。根據(jù)RDML（Real-Time PCR Data Markup Language）數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，建議統(tǒng)一使用定量循環(huán)(quantification cycle, Cq)這個(gè)術(shù)語(yǔ)。
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方法 |
分類(lèi) |
產(chǎn)品名稱(chēng) |
貨號(hào) |
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RNA提取 |
同Trizol提取 |
TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent |
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動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取，避開(kāi)有毒試劑，最快15 min完成 |
MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒 |
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簡(jiǎn)單植物總RNA提取，避開(kāi)有毒試劑，最快40min完成 |
MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 |
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多糖多酚植物總RNA提取，最快30min完成 |
MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 |
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細(xì)胞總RNA提取，避開(kāi)有毒試劑，最快8 min完成 |
MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒 |
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qPCR染料法 |
高靈敏通用型定量預(yù)混液(染料法) |
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix |
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超高性?xún)r(jià)比定量預(yù)混液 (染料法)，已發(fā)文章累計(jì)IF達(dá)到5000+ |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) |
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Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) |
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Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) |
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高靈敏型qPCR預(yù)混液（染料法） |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) |
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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) |
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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) |
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miRNA加A法高特異性定量預(yù)混液(染料法) |
Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） |
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miRNA莖環(huán)法高特異性定量預(yù)混液(染料法) |
Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（莖環(huán)法） |
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高靈敏一步法反轉(zhuǎn)定量試劑盒(染料法) |
Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit |
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細(xì)胞直擴(kuò)RT-qPCR，1.5 h從細(xì)胞到基因表達(dá)分析(染料法) |
Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit |
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反轉(zhuǎn)錄試劑 |
5 min快速反轉(zhuǎn)，最長(zhǎng)可滿(mǎn)足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-示蹤版New |
Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit |
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5 min快速反轉(zhuǎn)，最長(zhǎng)可滿(mǎn)足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-常規(guī)版New |
Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） |
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15 min一步完成gDNA去除與反轉(zhuǎn)錄(下游應(yīng)用qPCR) |
Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR |
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高質(zhì)量第一鏈cDNA合成預(yù)混液，含gDNA去除(下游應(yīng)用qPCR) |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
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最長(zhǎng)可滿(mǎn)足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR) |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) |
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常規(guī)30 min反轉(zhuǎn)預(yù)混液,含gDNA去除（下游應(yīng)用qPCR） |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
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miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加A法） |
Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） |
