Hieff^® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 適用于對各種動物細(xì)胞進(jìn)行基因定量表達(dá)分析（如cell line 化的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、各種干細(xì)胞、iPS 細(xì)胞等），無需提RNA，可直接進(jìn)行qPCR表達(dá)分析，用時短，操作簡單，出錯率低，最短只需1.5 h就可高效完成從模板制備到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及基因表達(dá)分析等步驟。該產(chǎn)品為探針法細(xì)胞直擴RT-qPCR試劑盒的反轉(zhuǎn)錄模塊，為補充試劑。

 

組分信息

組分編號	組分名稱	16815ES40	16815ES60
16815-A	4× Hifair® FCD RT Mix	200 μL	500 μL
16815-B	RNase Free H2O	2 mL	5 mL

 

儲存條件

長期保存時請于-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用說明

一、裂解產(chǎn)物的制備

1. 將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免起泡。沒有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會導(dǎo)致反應(yīng)性能下降。
2. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中*，5000 rpm離心2 min收集細(xì)胞**，充分吸除培養(yǎng)基。若細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)，可直接吸除培養(yǎng)基。
3. 各個孔內(nèi)加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細(xì)胞，5000 rpm離心2 min，吸盡FCD Washing Buffer。
4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室溫吸打混勻后靜置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右，即可得到裂解產(chǎn)物****，細(xì)胞數(shù)量超過1× 10⁵ cells時可能會有裂解殘留物屬正?，F(xiàn)象。

*50 μL裂解體系適配細(xì)胞數(shù)的基本要求是每孔1× 10² - 1× 10⁵ cells，若細(xì)胞數(shù)量較多，可適當(dāng)?shù)缺壤黾覨CD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同細(xì)胞的離心條件不同，請使用適合于所用細(xì)胞的離心速度進(jìn)行離心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實驗需要，加入裂解液量增大時需相應(yīng)增大FCD Stop Solution的量。

****細(xì)胞裂解產(chǎn)物溶液長期保存時，請置于-25~-15℃。

二、反轉(zhuǎn)錄

1. 室溫融化4× Hifair^® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系：

組分	體積 （μL）	終濃度
4× Hifair® FCD RT Mix	5	1×
裂解產(chǎn)物*	x	-
RNase-free H2O	Up to 20	-

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

*避免吸入細(xì)胞碎片，推薦使用量為2 μl，最大不超過反應(yīng)體系的55%。

2. 移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，按下表程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**：

反應(yīng)溫度	反應(yīng)時間
37℃	5 min
85℃	5 sec

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序

**反轉(zhuǎn)錄溫度推薦使用37℃，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進(jìn)行下游qRT-PCR檢測。為避免反轉(zhuǎn)錄體系對qPCR反應(yīng)的抑制，得到合適的Ct值（10-35），可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內(nèi)不進(jìn)行下游實驗，可放置于-25~-15℃保存。

三、熒光定量PCR

1. 體系配置

使用下列組份比例配制反應(yīng)液（配制過程請于冰上進(jìn)行）：

組分	體積（μL）	終濃度
2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix	12.5	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	200 nM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	200 nM
Probe (10 μM)	0.25-1	100-400 nM
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物*	x	-
RNase-free H2O	Up to 25	-

表3 qPCR反應(yīng)體系

*高濃度模板易導(dǎo)致非特異擴增，可適當(dāng)將模板稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL。反應(yīng)性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物探針濃度。

2. 熒光定量PCR快速擴增程序（推薦）

本產(chǎn)品推薦使用快速程序擴增，可大大減少反應(yīng)時間。使用Tm值較低的引物難以擴增時，可額外調(diào)整退火溫度。

循環(huán)步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	10 sec	1
變性	95℃	5 sec	45
退火/延伸**	60℃	10 sec

表4 qPCR反應(yīng)程序（快速）

**退火/延伸溫度、終延伸時間可根據(jù)實驗要求適當(dāng)調(diào)整。 快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)基因可嘗試常規(guī)程序。

3. 熒光定量PCR常規(guī)擴增程序

實驗儀器不滿足快速反應(yīng)時間時，也可使用常規(guī)程序進(jìn)行擴增。

循環(huán)步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	10 sec	1
變性	95℃	15 sec	40-45
退火/延伸**	60℃	30 sec

表5 qPCR反應(yīng)程序（常規(guī)）

 

注意事項

1. 使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
2. 實驗時，請盡量使用無污染的耗材，避免污染。
3. 本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融，配制時應(yīng)避免強光照射。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
5. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

Ver.CN20231207