Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 適用于對(duì)各種動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行RNA提取（如cell line 化的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、各種干細(xì)胞、iPS 細(xì)胞等），無(wú)需提RNA，可直接進(jìn)行qPCR表達(dá)分析，用時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，出錯(cuò)率低，最短只需1.5小時(shí)就可高效完成從模板制備到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及基因表達(dá)分析等步驟。該產(chǎn)品為染料法細(xì)胞直擴(kuò)RT-qPCR試劑盒的反轉(zhuǎn)錄模塊，為補(bǔ)充試劑。

 

組分信息

組分編號(hào)	組分名稱(chēng)	16812ES40	16812ES60
16812-A	4× Hifair® FCD RT Mix	200 μL	500 μL
16812-B	RNase Free H2O	2 mL	5 mL

 

儲(chǔ)存條件

長(zhǎng)期保存時(shí)請(qǐng)于-25~-15℃保存，有效期6個(gè)月。

 

使用說(shuō)明

一、裂解產(chǎn)物的制備

1. 將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免起泡。沒(méi)有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)性能下降。
2. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中*，5000 rpm離心2 min收集細(xì)胞**，充分吸除培養(yǎng)基。若貼壁細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)，可直接吸除培養(yǎng)基。
3. 各個(gè)孔內(nèi)加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細(xì)胞，5000 rpm離心2 min，吸盡FCD Washing Buffer。
4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室溫吸打混勻后靜置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右，即可得到裂解產(chǎn)物****，細(xì)胞數(shù)量超過(guò)1× 10⁵ cells時(shí)可能會(huì)有裂解殘留物屬正?，F(xiàn)象。

*50 μL裂解體系適配細(xì)胞數(shù)的基本要求是每孔1× 10⁴，該試劑盒可使用范圍是1 × 10³ - 1 × 10⁶ cells，若細(xì)胞數(shù)量較多，可適當(dāng)?shù)缺壤黾覨CD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同細(xì)胞的離心條件不同，請(qǐng)使用適合于所用細(xì)胞的離心速度進(jìn)行離心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實(shí)驗(yàn)需要，加入裂解液量增大時(shí)需相應(yīng)增大FCD Stop Solution的量。

****細(xì)胞裂解產(chǎn)物溶液長(zhǎng)期保存時(shí)，請(qǐng)置于-25~-15℃。

二、反轉(zhuǎn)錄

1. 室溫融化4× Hifair^® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系：

組分	體積 （μL）	終濃度
4× Hifair® FCD RT Mix	5	1×
裂解產(chǎn)物*	x	-
RNase-free H2O	Up to 20	-

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

*避免吸入細(xì)胞碎片，推薦使用量為2-5 μl，最大不超過(guò)反應(yīng)體系的45%。

2. 移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，按下表程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**：

反應(yīng)溫度	反應(yīng)時(shí)間
55℃	15 min
85℃	5 min

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序

**反轉(zhuǎn)錄溫度推薦使用55℃，對(duì)于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將反轉(zhuǎn)錄溫度提高到 60℃。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進(jìn)行下游RT-qPCR檢測(cè)。為避免反轉(zhuǎn)錄體系對(duì)qPCR反應(yīng)的抑制，得到合適的Ct值（10-35），可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時(shí)間內(nèi)不進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，可放置于-25~-15℃保存。

三、熒光定量PCR

1. 體系配置

使用下列組份比例配制反應(yīng)液（配制過(guò)程請(qǐng)于冰上進(jìn)行）：

組分	體積（μL）	終濃度
2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix	10	1×
Forward Primer (10 μM)	0.4	200 nM
Reverse Primer (10 μM)	0.4	200 nM
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物*	x	-
RNase-free H2O	Up to 20	-

表3 qPCR反應(yīng)體系

*反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加入量不要超過(guò)RT-qPCR體積的1/10。高濃度模板易導(dǎo)致非特異擴(kuò)增，適當(dāng)稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL，盡量不要超過(guò)6 μL。反應(yīng)性能較差時(shí)，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。

2. 熒光定量PCR常規(guī)擴(kuò)增程序（推薦）

循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	30 sec	1
變性	95℃	10 sec	35-40
退火/延伸	60℃	30 sec
熔解曲線(xiàn)階段	儀器默認(rèn)設(shè)置		1

表4 qPCR反應(yīng)程序（常規(guī)）

3. 熒光定量PCR快速擴(kuò)增程序

實(shí)驗(yàn)條件允許時(shí)，也可使用快速程序進(jìn)行擴(kuò)增。

循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	10 sec	1
變性	95℃	5 sec	40
退火/延伸**	60℃	10 sec
熔解曲線(xiàn)階段	儀器默認(rèn)設(shè)置		1

表5 qPCR反應(yīng)程序（快速）

**退火/延伸溫度、終延伸時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)調(diào)整。 快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個(gè)別復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)基因可嘗試常規(guī)程序。

 

注意事項(xiàng)

1. 使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
2. 實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)盡量使用無(wú)污染的耗材，避免污染。
3. 本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融，配制時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光照射。
4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
5. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

Ver.CN20231207