產(chǎn)品描述

Alkaline Phosphatase，中文名堿性磷酸酶，可將DNA、RNA的5’端磷酸基團(tuán)去除，常用于阻止載體的自連作用：在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，DNA連接酶催化DNA連接時(shí)需要有磷酸基團(tuán)的存在，載體在經(jīng)酶切后會(huì)在切點(diǎn)端保留一個(gè)磷酸基團(tuán)。而載體經(jīng)堿性磷酸酶去磷酸化后因5’端無磷酸基團(tuán)，因而不可以和自身3’端連接。因此連接反應(yīng)中載體本身會(huì)優(yōu)先發(fā)生的連接反應(yīng)被阻止，提高了目的片段插入率。另外，堿性磷酸酶還可制備用于5’端標(biāo)記的DNA模板，以及用于該酶蛋白的脫磷酸作用等。

本品為小牛腸來源的堿性磷酸酶，可以降解幾乎所有磷酸單酯，但是該酶不能水解磷酸二酯或磷酸三酯。

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)	組分名稱	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
		10321ES80（1000 U）
10321-A	Alkaline Phosphatase (30 U/μL)	1000 U
10321-B	10×AP buffer	1 mL

產(chǎn)品性質(zhì)

來源（Source）	攜帶小牛腸堿性磷酸酶表達(dá)質(zhì)粒的酵母
質(zhì)量控制（Quality Control）	無核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶、核糖核酸酶污染
熱滅活（Thermal Inactivation）	在螯合劑存在下，65℃加熱30 min，99%活性不可逆喪失；使用苯酚，可使酶完全失活。
儲(chǔ)存液條件（Storage   conditions）	10 mM Tris-HCl（pH8.0），1 mM MgCl2，50 mM KCl，0.1 mM   ZnCl2，50% glycerol.
活性定義（Unit definition）	在pH9.8，37℃條件下，以對(duì)硝基苯酚磷酸鹽（p-nitrophenylphosphate）為底物，1分鐘生成1 µmol硝基酚(p-nitrophenol)所用的堿性磷酸酶量定義為1個(gè)活力單位。
最佳pH（Optimal pH）	該酶在底物濃度高的情況下其最佳反應(yīng)pH為10，在底物濃度低時(shí)，最佳pH為8，此時(shí)該酶活性較高濃度底物時(shí)稍低。
優(yōu)化體系（Optimal Buffer）	AP Buffer（500 mM Tris-HCl pH9.0，10 mM   MgCl2）

運(yùn)輸和保存方法

干冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期18個(gè)月。

注意事項(xiàng)

1）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
2）本產(chǎn)品僅作科研用途！

使用方法

1 DNA去磷酸化

① 在1.5 mL離心管中加入下列試劑：

組分	體積
無菌ddH2O	Up to 50 µL
DNA 片段*	1-20 pmol
Alkaline   Phosphatase	1-2 µL
10×AP buffer	5 µL

【*】單鏈DNA或含5’端突出末端的DNA推薦低溫下孵育，平末端DNA或含3’突出末端的DNA建議在較高溫度下孵育。

② 混勻上述試劑，于37℃或50℃孵育30 min。或者37℃孵育15 min后，再于50℃孵育15 min。

 

2 酚氯仿法抽提DNA

① 苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）抽提2次。

【注】：推薦在酚提取前將其在含5 mM EDTA，0.5% SDS，50 μg/mL Proteinase K的溶液中56℃孵育30 min以徹底滅活堿性磷酸酶。在酚提取前于75℃孵育10 min，滅活效果更佳。

② 氯仿/異戊醇（24:1）抽提。

 

3 乙醇沉淀DNA

① 加入2.5 µL 3 M NaCl（終濃度150 mM）。

② 加入125 µL（2.5倍體積）預(yù)冷乙醇，混勻后于-20℃放置30-60 min，沉淀DNA。

 

4 溶解DNA

離心，徹底去除乙醇后，將DNA溶于適量去離子水（＜20 µL）。

相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (1 U/μl) 蝦堿性磷酸酶	10322ES72	250 U
Exonuclease I (E. coli) I型核酸外切酶	10320ES81/93	1500 U/15000U

HB210709