產(chǎn)品簡(jiǎn)介

 

游離膽固醇(FC)是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，也是合成性激素、膽汁酸、維生素D和腎上腺皮質(zhì)激素等物質(zhì)的重要原料，F(xiàn)C濃度可作為脂代謝的指標(biāo)。本試劑盒的檢測(cè)方法是微量法，既可以用可見分光光度計(jì)檢測(cè)，也可以用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

作用原理是FC氧化酶可催化FC生成4-膽甾烯酮和H₂O₂，過氧化物酶催化H₂O₂、4-氨基安替比林和酚生成紅色醌類化合物，其在500 nm有吸收峰，顏色深淺與FC含量成正比。作用方式如下：

測(cè)定總膽固醇(TC)請(qǐng)選擇60723ES 總膽固醇(TC)含量檢測(cè)試劑盒；測(cè)定游離膽固醇(FC)請(qǐng)選擇60724ES 游離膽固醇(FC)含量檢測(cè)試劑盒。

 

組分信息

 

組分編號(hào)	組分名稱	規(guī)格	儲(chǔ)存條件
60724-A	試劑一	30 mL	2～8℃
60724-B	試劑二	160 μL	2～8℃
60724-Ｃ	標(biāo)準(zhǔn)品	10 mg	2～8℃

 

儲(chǔ)存條件

 

2～8℃保存，有效期6個(gè)月。

 

使用說明

 

【注意事項(xiàng)】實(shí)驗(yàn)之前建議選擇3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)，建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

1.需自備的儀器和溶劑：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、可調(diào)式移液槍、EP管、蒸餾水和異丙醇。

2.溶液的配制：

1）自備提取液異丙醇：大約需要110 mL，常溫保存；試劑盒內(nèi)提供一個(gè)30 mL棕色空瓶，僅做分裝使用。

2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置：10 mg膽固醇使用前加入517 μL提取液，振蕩溶解后即為50 μmol/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，2～8℃可保存4周。

3）工作液的配制：根據(jù)樣本量將試劑一：試劑二按 3 mL：20 μL（約16T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3.操作步驟：

1）樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

a.組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為 1：5～10 的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000 g，4℃離心10 min，取上清置冰上待測(cè)。

b.細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為 500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300 w，超聲2秒，間隔3秒，總時(shí)間3 min）；然后 10000 g，4℃離心10 min， 取上清置于冰上待測(cè)。

c.血清（漿）等液體樣本：直接測(cè)定，若有沉淀請(qǐng)離心后取上清待測(cè)。

2）測(cè)定步驟

a.可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至500 nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

b.按需取出一定量的工作液，臨用前37℃預(yù)熱10 min以上。

c.將50 μmol/mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用提取液進(jìn)行稀釋得到2.5、2、1.25、0.625、0.3125、0.15625 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品備用。

序號(hào)	稀釋前濃度（μmol/mL）	標(biāo)準(zhǔn)品體積（μL）	提取液體積（μL）	稀釋后濃度（μmol/mL）
1	50	50	950	2.5
2	2.5	800	200	2
3	2	625	375	1.25
4	1.25	500	500	0.625
5	0.625	500	500	0.3125
6	0.3125	500	500	0.15625

備注：下述實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需20 µL標(biāo)準(zhǔn)品（注意不要在此步驟直接檢測(cè)吸光度）。

d.在1.5 mL EP管/96孔板按下表步驟加樣

試劑名稱（µL）	測(cè)定管	標(biāo)準(zhǔn)管	空白管
樣本	20	-	-
標(biāo)準(zhǔn)品	-	20	-
提取液	-	-	20
工作液	180	180	180
充分混勻，37℃靜置30 min，反應(yīng)完成后測(cè)定500 nm處吸光值A(chǔ)，分別記為A測(cè)定、A標(biāo)準(zhǔn)和A空白，ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白?？瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)1-2個(gè)。注：若樣本為血清，則空白管中的提取液（異丙醇）需要更換為蒸餾水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A血清（漿）空白，標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定及ΔA標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算不變。

4.總膽固醇含量計(jì)算：

a.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)定（y，ΔA測(cè)定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x，μmol/mL）。

b.游離膽固醇的計(jì)算

（1）按血清（漿）等液體體積計(jì)算：FC含量（μmol/dL）=x×100×F

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算：FC含量（μmol/mg prot）=x×V提取÷（Cpr×V提?。?times;F =x÷Cpr×F

（3）按樣本質(zhì)量計(jì)算：FC含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×V提取÷W×F =x÷W×F

（4）按細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：FC含量（μmol/10⁶ cell）=x×V提取÷N×F =x÷N×F

100：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1 dL=100 mL；V提?。杭尤霕颖镜奶崛∫后w積，1 mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞/細(xì)菌總數(shù)，以10⁶計(jì)；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；F：樣本稀釋倍數(shù)。

5.實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

（1）取0.1054 g大鼠腎臟加入1 mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.385-0.067=0.318，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.3971x+0.0051，R²=0.9981，計(jì)算x=0.788，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：FC 含量（μmol/g 質(zhì)量）=x÷W×F =7.476 μmol/g 質(zhì)量。

（2）取 5×10⁶個(gè)BNL細(xì)胞加入1 mL提取液進(jìn)行超聲破碎，按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.112-0.067=0.045，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.3971x+0.0051，R²=0.9981，計(jì)算x=0.100，按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算含量得：FC 含量（μmol/10⁶ cell）= x÷N×F =0.02 μmol/10⁶ cell。  

（3）取人血清樣本，直接按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.194-0.067=0.128，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.3971x+0.0051，R²=0.9981，計(jì)算x=0.309，按血清（漿）等液體體積計(jì)算含量得：FC 含量（μmol/dL）=x×100×F=30.7 μmol/dL。

 

注意事項(xiàng)

 

1.如果測(cè)定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用提取液稀釋樣本（血清（漿）用蒸餾水稀釋）后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

2.提取液中含有使蛋白變形的成分，故按蛋白濃度計(jì)算時(shí)需要重新提取蛋白進(jìn)行測(cè)定。

3.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4.本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

 

Ver.CN20240924