l 背景介紹：
高通量測序技術(shù)的發(fā)展，帶來的是測序成本的慢慢降低。但是這并不意味著對測序之后得到的極其龐大的數(shù)據(jù)量的分析工作也隨之變得簡單。恰恰相反，更高的測序深度導(dǎo)致測序的數(shù)據(jù)量越來越大，分析工作也是愈加困難。于是近年來測序技術(shù)的發(fā)展出現(xiàn)了兩個極端的方向，一個是大而全的全基因組測序（Whole Genome Sequencing），另一種就是小而精的靶向捕獲測序（Target Capture Sequencing）。
圖1. 靶向捕獲測序示意圖
與全基因組測序相比，捕獲測序可以針對感興趣的區(qū)域進行分離與富集，不僅檢測靈敏度更高，而且大大降低后續(xù)的數(shù)據(jù)分析工作。舉例來說，外顯子組區(qū)域僅占全基因組的1%左右，但卻包含了絕大部分的已知致病突變，將外顯子區(qū)域分離出來后單獨進行測序，后續(xù)的分析就能降低99%的工作量，極大的加快分析的速度。不僅如此，在遺傳突變、腫瘤篩查等領(lǐng)域，靶向捕獲所能達到的靈敏度也是全基因組測序完全無法實現(xiàn)的。由于捕獲測序在測序前就對基因的目標(biāo)區(qū)域進行了分離與富集，目標(biāo)區(qū)域的大幅減少可實現(xiàn)5000×甚至更高的測序深度。測序深度的提高意味著更高的靈敏度（能夠檢測低頻率的變異），其檢測極限低至0.1%。因此，在精準(zhǔn)醫(yī)療時代，小而精的靶向捕獲測序似乎更受科學(xué)家的偏愛。
那說了這么多，如何才能將我們的感興趣的區(qū)域捕獲出來呢？
l 常見的捕獲手段
常見的目標(biāo)區(qū)域捕獲方法主要有三種，雜交捕獲（Hybrid Capture）、分子倒置探針（Molecular Inversion Probes）以及多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction）。
1、雜交捕獲
雜交捕獲根據(jù)核酸分子堿基互補雜交原理，針對目標(biāo)區(qū)域設(shè)計特異探針并將探針合成在固相或液相芯片上，然后打斷基因組DNA，加上測序接頭后與探針雜交，將基因組DNA目標(biāo)區(qū)域捕獲下來，回收目標(biāo)DNA片段，直接構(gòu)建高通量測序文庫。一般來說，雜交捕獲根據(jù)探針的狀態(tài)不同分為固態(tài)雜交和液態(tài)雜交。前者以羅氏公司的NimbleGen為代表，后者以Agilent SureSelect為代表。
a. 固態(tài)雜交: 本質(zhì)就是芯片，芯片上布滿了探針，將制備好的文庫與芯片上的探針雜交，洗脫未結(jié)合的片段，回收被探針富集的DNA片段。探針長度為50-105bp不等。其探針密度和序列都可以自己設(shè)置（一般來說，針對一個區(qū)段的探針密度越大，其捕獲成功率越高）。
圖2. Roche NimbleGen捕獲技術(shù)流程示意圖
b.液態(tài)雜交：探針存在于液相種，探針攜帶生物素。當(dāng)探針與目標(biāo)區(qū)段雜交之后，通過鏈親和素修飾的磁珠將探針吸附，未被捕獲的片段扔掉。之后通過變性可以將探針和目標(biāo)區(qū)段分開，然后利用磁珠將所有空探針吸附丟棄，目標(biāo)區(qū)段捕獲完成。
圖3. Agilent SureSelect捕獲技術(shù)流程示意圖
優(yōu)點：捕獲的區(qū)段大，均一性好。
缺點：特異性差。因為樣本是隨機打斷，捕獲時候可能與部分目的區(qū)段雜交，導(dǎo)致含有部分目的區(qū)段的片段被捕獲。
2、分子倒置探針
分子倒置探針(MIP)技術(shù)優(yōu)勢是特異性好而且捕獲完成后的片段直接完成了建庫（雜交捕獲后還需要構(gòu)建測序文庫，主要是添加Index和測序接頭）。其原理是設(shè)計一個口袋狀探針，探針結(jié)構(gòu)如圖所示，H1和H2能和目標(biāo)區(qū)段退火，然后利用DNA聚合酶將探針缺口補齊，同時添加DNA連接酶，將缺口處磷酸二酯鍵連接，即可構(gòu)成一個完整的環(huán)狀探針。然后通過外切酶將游離的探針消化，完整的探針包括目標(biāo)區(qū)段的序列，利用通用序列（H1、H2之間序列）作為后續(xù)文庫構(gòu)建的引物（可添加index和測序引物），擴增產(chǎn)物可以直接作為二代測序文庫。
圖4.分子倒置探針示意圖（From Wikipedia）
圖5. MIP捕獲技術(shù)流程示意圖（From Wikipedia）
優(yōu)點：特異性高
缺點：捕獲效率不高。
3、多重PCR
目前多重PCR捕獲是目前應(yīng)用比較廣泛的，比較適合大規(guī)模樣本。本文主要以Life公司和Illumina公司的兩種方法做介紹：
Ion Ampliseq(Thermo Fisher)
Ion Ampliseq關(guān)鍵之處在于引物設(shè)計，該公司設(shè)計的引物可以滿足1000-2000重單管反應(yīng)并且不產(chǎn)生引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。
圖6. Ion Ampliseq技術(shù)流程示意圖
優(yōu)點：方法簡單，起始量低至10ng，在PCR產(chǎn)物以及石蠟樣本中有明顯優(yōu)勢。
難點：引物池是需要豐富的引物設(shè)計經(jīng)驗，目前只有thermo做的好，并且將經(jīng)驗做成了軟件，登陸www.ampliseq.com提交序列即可。
Illuminna Trueseq(Illumina)
針對目標(biāo)區(qū)段設(shè)計兩段探針，探針和DNA雙鏈中的一條鏈雜交，通過DNA聚合酶和DNA連接酶的作用，將探針中間的缺口補齊。上下游探針攜帶有通用序列，之后利用攜帶通用序列的建庫引物（index和測序引物等）進行擴增以后即完成建庫。
圖7. Illumina Trueseq技術(shù)流程示意圖
優(yōu)點：保證多個擴增子擴增效率的一致性
難點：連接反應(yīng)操作繁瑣，并且對起始模板濃度要求比較高。
l 三種捕獲技術(shù)比較
綜上，目前常見的三種捕獲建庫方法中：雜交捕獲的區(qū)段大，且均一性好，但是有些含有部分目的區(qū)段的片段也可能被捕獲，導(dǎo)致特異性差；分子倒置探針特異性比較高，但同時高特異性會影響捕獲的效率；而多重PCR優(yōu)勢在于操作簡單，自己設(shè)計引物即可，但是難點也在引物設(shè)計：如何保證擴增的特異性，如何避免引物二聚體等。詳情見下表：
表 三種捕獲測序技術(shù)對比分析
參考文獻：
Mamanova L, Coffey AJ, Scott CE. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat Methods. 2010 Feb;7(2):111-8.
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