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干貨│基因編輯探秘系列之在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

近年來(lái)，隨著診療體系從傳統(tǒng)的以醫(yī)院為中心變?yōu)槿ブ行幕?，檢測(cè)場(chǎng)景從醫(yī)院檢測(cè)變成社區(qū)或家用檢測(cè)，開(kāi)發(fā)規(guī)模化、自動(dòng)化、快速化的檢測(cè)技術(shù)成為趨勢(shì)?？茖W(xué)界發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)除在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用以外，在POCT檢測(cè)工具開(kāi)發(fā)方面同樣具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，將現(xiàn)有技術(shù)結(jié)合CRISPR/Cas系統(tǒng)，有望開(kāi)發(fā)速度更快、靈敏度更高、成本更低、檢測(cè)特異性更好、操作更便利的POCT檢測(cè)工具。目前，基于不同的Cas蛋白，研究者們已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)出多種創(chuàng)新的檢測(cè)方法，為未來(lái)體外診斷技術(shù)的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

 

圖1.不同Cas蛋白特點(diǎn)及應(yīng)用[1]

 

 

基于Cas9的檢測(cè)系統(tǒng)

 

Cas9屬于II型系統(tǒng)，有兩個(gè)內(nèi)切酶功能域RuvC和HNH，在sgRNA的引導(dǎo)下，Cas9通過(guò)識(shí)別靶標(biāo)DNA上的PAM序列，特異性地與靶標(biāo)DNA結(jié)合，并切割靶標(biāo)DNA，其原理如圖2（A）所示。

 

 
 
 
 

通過(guò)將NASBA和CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合，Pardee等人建立了NASBACC （NASBA-CRISPR Cleavage）技術(shù)，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)寨卡病毒的檢測(cè)。NASBACC技術(shù)原理（如圖2（B））如下：通過(guò)NASBA技術(shù)，對(duì)靶標(biāo)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的帶有toehold開(kāi)關(guān)觸發(fā)序列的dsDNA。若dsDNA含有特異性PAM序列，將被CRISRP/Cas9切割成兩段短序列，在T7 RNA聚合酶作用下無(wú)法轉(zhuǎn)錄出帶有toehold開(kāi)關(guān)觸發(fā)的完整序列，因此無(wú)法使傳感器H變色。若dsDNA不含有特異性PAM序列，在T7 RNA聚合酶作用下，獲得帶有toehold開(kāi)關(guān)觸發(fā)的完整序列，從而激發(fā)傳感器H變色。該方法無(wú)需復(fù)雜的溫度循環(huán)步驟、靈敏度高、特異性強(qiáng)，將病原體的有無(wú)轉(zhuǎn)化為肉眼可見(jiàn)的顏色變化，檢測(cè)結(jié)果更直觀。

 

圖2.Cas9及NASBACC作用原理圖[2][3]

 

 

基于Cas12的檢測(cè)系統(tǒng)

 

與Cas9不同，Cas12除了能以PAM依賴的方式識(shí)別和切割dsDNA，還能夠不依賴PAM序列特異性識(shí)別并切割ssDNA（單鏈DNA)。此外，Cas12除靶標(biāo)DNA切割活性外，在Cas12、sgRNA和靶標(biāo)DNA形成三元復(fù)合物后，能激發(fā)其反式切割活性，將體系中任意ssDNA序列切碎。利用其反式切割活性，研究者們基于Cas12a和Cas12b構(gòu)建了多種新型核酸診斷技術(shù)，大大提高了病原體或疾病診斷的靈敏度和準(zhǔn)確性。

 

圖3.不同Cas蛋白作用原理[4]

 

DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)技術(shù)

 
 
 
 

DETECTR是一種基于CRISPR/Cas12a和RPA（重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)）的檢測(cè)系統(tǒng)，用于快速、靈敏地檢測(cè)特定DNA序列。DETECTR系統(tǒng)采用RPA對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增富集，并通過(guò)設(shè)計(jì)特定的crRNA，使其能夠精確識(shí)別目標(biāo)DNA序列,一旦Cas12a識(shí)別到目標(biāo)，其反式切割活性被激活，體系中熒光標(biāo)記的ssDNA報(bào)告分子被切割，產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而指示目標(biāo)DNA的存在。

 

圖3.DETECTR作用原理[5]

 

HOLMES（Hybridization-based Optical Label-free Multiplexed Efficient Sensing）技術(shù)

 
 
 
 

HOLMES技術(shù)與DETECTR檢測(cè)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)處于同一時(shí)期，都是基于CRISPR/Cas12a的檢測(cè)系統(tǒng)。該技術(shù)通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)靶序列進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與Cas12a-crRNA結(jié)合，激活Cas12a的反式切割活性，對(duì)ssDNA熒光探針進(jìn)行切割，釋放熒光基團(tuán)，形成檢測(cè)信號(hào)。

 

圖4.HOLMES作用原理[6]

 

HOLMES V2技術(shù)

 
 
 
 

HOLMES V2則是HOLMES技術(shù)的升級(jí)版，它在保持原有技術(shù)優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，核酸擴(kuò)增技術(shù)增加了LAMP/RT-LAMP技術(shù)，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)升級(jí)至CRISPR/Cas12b，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。HOLMES V2而且不僅能應(yīng)用于DNA靶標(biāo)，也能用于RNA靶標(biāo)的檢測(cè)，為疾病的早期診斷和治療提供了有力工具。

 

圖5.HOLMES V2作用原理[7]

 

 

基于Cas13的檢測(cè)系統(tǒng)

 

Cas13屬于VI型系統(tǒng)，具有靶向切割目標(biāo)RNA的能力。Cas13含有兩個(gè)高等真核生物和原核生物核苷酸(HEPN)結(jié)合域，Cas13僅憑單個(gè)crRNA的引導(dǎo)便可與靶標(biāo)RNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，并特異性地對(duì)靶標(biāo)RNA進(jìn)行順式剪切。此外，與Cas12類似，Cas13也具有反式切割活性，在識(shí)別到特定的RNA序列后，將體系中任意ssDNA序列切碎，其原理見(jiàn)圖6（A）。這一特性使得Cas13成為檢測(cè)RNA的理想選擇，特別是在病毒性疾病的快速診斷中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。

 

 
 
 
 

通過(guò)將CRISPR/Cas13a和RPA技術(shù)結(jié)合，張鋒團(tuán)隊(duì)建立了SHERLOCK技術(shù)。該系統(tǒng)首先用RPA或RT-RPA技術(shù)對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，再利用T7 RNA聚合酶將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RNA分子，與Cas13a/crRNA特異結(jié)合形成復(fù)合物，激活Cas13a的反式切割活性，對(duì)體系中熒光標(biāo)記的FQ-ssRNA探針進(jìn)行切割，發(fā)出熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)（如圖6（B））。

 

圖6.Cas13a及SHERLOCK作用原理圖[8]

 

 

基于Cas14的檢測(cè)系統(tǒng)

 

Cas14屬于V型系統(tǒng)，是一個(gè)非常緊湊的RNA引導(dǎo)核酸酶家族(400到700個(gè)aa)，其大小僅為Cas9和Cas12的一半。Cas14具備不依賴PAM切割和反式切割ssDNA能力，同時(shí)可在PAM的引導(dǎo)下切割dsDNA。與Cas12不同，Cas14對(duì)靶標(biāo)與crRNA之間的核苷酸堿基錯(cuò)配的耐受性較低，導(dǎo)致可靶向范圍窄，能夠用于高精度的核酸檢測(cè)，如單核苷酸多態(tài)性基因分型。

 

 
 
 
 

通過(guò)將CRISPR/Cas14和擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合，Doudna等建立了DETECTR/Cas14技術(shù)。該系統(tǒng)首先采用RPA或RT-RPA技術(shù)對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，且其中一條擴(kuò)增引物采用磷硫?；揎棧ǚ乐贡籘7核酸外切酶切割）。使用T7核酸外切酶對(duì)擴(kuò)增富集生成的靶標(biāo)dsDNA進(jìn)行處理，T7核酸外切酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物其中一條鏈，擴(kuò)增產(chǎn)物中帶有磷硫?；揎椀囊粭l鏈被保留下來(lái)。當(dāng)Cas14特異性識(shí)別靶標(biāo)ssDNA時(shí)，其反式切割活性被激活，體系中熒光標(biāo)記的ssDNA報(bào)告分子被切割，產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而指示目標(biāo)DNA的存在。

 

圖7.Cas14及DETECTR-Cas14作用原理圖[9]

 

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為基因編輯和體外診斷技術(shù)的基石，不同的Cas蛋白在應(yīng)用中展現(xiàn)出各自獨(dú)特的功能和優(yōu)勢(shì)，這些特性使得各個(gè)Cas蛋白在體外診斷檢測(cè)系統(tǒng)中展現(xiàn)出了巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新，CRISPR/Cas技術(shù)將在未來(lái)的醫(yī)療健康領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。

 

 

相關(guān)產(chǎn)品推薦

 

產(chǎn)品定位

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號(hào)

Cas系列

Cas9 Nuclease

14701ES

ArCas12a Nuclease

14702ES

AapCas12b Nuclease

14808ES

RT-LAMP系列

Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL)

14402ES

Hifair® III Reverse Transcriptase

11111ES

RPA系列

Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)

11078ES

T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)

11079ES

T4 UvsY protein (2 μg/μL)

11080ES

T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌體基因32編碼蛋白

11081ES

Creatine Kinase (2 μg/μL) 肌酸激酶

14502ES

Exonuclease III (100 U/μL)

14525ES

 

參考文獻(xiàn)

[1] 孫雯君,黃行許,王鑫杰.基于CRISPR的快速靈敏便捷分子檢測(cè)[J].生物工程學(xué)報(bào), 2023, 39(1):14.

[2] Jiang, F, Doudna, J. A. (2017). CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual review of biophysics, 46, 505–529.

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[7] Li L, Li S, Wu N, et al. HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection and DNA Methylation Quantitation. ACS Synth Biol. 2019;8(10):2228-2237. doi:10.1021/acssynbio.9b00209.

[8] Myhrvold C, Freije CA, Gootenberg JS, et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 2018 Apr 27;360(6387):444-448.

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