操作環(huán)境中的氣溶膠污染是造成PCR結(jié)果假陽性常見的因素。美國(guó)科學(xué)家Lindahl最早在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶），UDG酶與dUTP搭配使用，可建立PCR防污染體系，保證PCR擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。
UDG酶可有效催化水解單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架的N-糖苷鍵，但對(duì)RNA無活性。使用UDG酶時(shí)，以dUTP取代dTTP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR反應(yīng)開始前，UDG酶能降解含尿嘧啶的PCR產(chǎn)物，消除PCR殘余污染。
UDG酶作用原理
dUTP/UDG酶是作為PCR反應(yīng)體系的配制成分發(fā)揮防污染作用的。PCR反應(yīng)前，在25℃、10 min的條件下，UDG酶催化水解含有dU-DNA鏈中的尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架的N-糖苷鍵，產(chǎn)生缺嘧啶位點(diǎn)，釋放游離尿嘧啶。然后進(jìn)行95℃、2 min熱處理，使UDG酶失活。同時(shí)，高溫使得缺嘧啶位點(diǎn)的磷酸骨架極易水解斷裂，從而消除含有尿嘧啶的PCR產(chǎn)物的污染。天然的、未經(jīng)修飾的DNA不含dU，不受UDG酶影響，可繼續(xù)作為PCR/qPCR擴(kuò)增的模板進(jìn)行擴(kuò)增。
圖1. dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)去除殘留擴(kuò)增污染物示意圖
UDG酶的類型
目前市售UDG酶主要包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌來源的普通UDG酶及嗜冷海洋細(xì)菌來源的熱敏型UDG酶兩種類型。普通UDG酶較為耐熱，經(jīng)95℃、10 min處理仍會(huì)殘留有少量的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性，熱敏型UDG酶則對(duì)溫度敏感，50℃、5min即可完全失活，避免了常規(guī)UDG酶滅活后可能存在的殘留活性在常溫下對(duì)含dU擴(kuò)增產(chǎn)物的降解作用。
翌圣生物-熱敏UDG酶
1. 產(chǎn)品特性
Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG),heat-labile,1 U/μL（Cat#10303ES）來源于嗜冷海洋細(xì)菌，是經(jīng)大腸桿菌表達(dá)純化的重組蛋白，在25-37℃發(fā)揮活性，熱敏感，50℃、10 min或95℃、2 min即發(fā)生不可逆滅活。
1）10 U本品經(jīng)E.coli 16S rDNA特異性的TaqMan qPCR檢測(cè)，E.coli基因組殘留低于10拷貝。
2）無核酸內(nèi)外切酶和RNase殘留。
3）尿嘧啶是此酶識(shí)別的唯一堿基。
2. 使用方法（僅供參考）
1）根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，dUTP終濃度可在0.2~0.6 mM之間調(diào)整，并選擇性摻入0.2 mM dTTP。
2）反應(yīng)體系中熱敏UDG酶的添加量為1個(gè)單位，30 min內(nèi)可消化1 μg dU-DNA。
3）PCR反應(yīng)程序前加上25℃~37℃，2~10 min的保溫步驟活化UDG酶活性。
4）根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，正常進(jìn)行后續(xù)PCR程序。
3. 0.025U熱敏UDG酶即可完全消化360 ng 200 bp的dU-DNA。
圖2. 0.05 U、0.025 U、0.0125 U、0.00625 U、0.003125 U熱敏UDG酶與360 ng 200 bp dU-DNA在25℃孵育30 min（95℃、2 min滅活）電泳結(jié)果圖。
4. 應(yīng)用場(chǎng)景
1）去除單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧啶堿基，對(duì)RNA無活性。
2）去除PCR殘留污染，消除由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。
3）適用于PCR、qPCR、RT-qPCR等反應(yīng)。
FAQ
Q1: UDG酶可以用于已存在的擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染嗎？
A: 已存在的擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染不含dU，此時(shí)UDG酶不能發(fā)揮作用。建議選取其他擴(kuò)增區(qū)域，重新設(shè)計(jì)引物，并建立dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)，即可避免“未來”的氣溶膠污染。
Q2: dUTP會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的dU-DNA在雜交、測(cè)序、克隆和酶切等方面的下游應(yīng)用嗎？
A：含dU的PCR產(chǎn)物可正常進(jìn)行核酸雜交和測(cè)序，效果與常規(guī)PCR產(chǎn)物無差別。在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，連接產(chǎn)物需使用UDG酶缺失的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒擴(kuò)增。酶切實(shí)驗(yàn)中，已證實(shí)EcoRI和BamHI不受dU影響，但HindIII酶切效率有所降低，更多內(nèi)切酶效果還需自行嘗試。
Q3: 含dU的PCR產(chǎn)物后續(xù)做了連接和轉(zhuǎn)化，無克隆，這是什么原因？
A: 需要特別注意在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，連接產(chǎn)物需使用UDG酶缺失的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和后續(xù)的質(zhì)粒擴(kuò)增。
Q4: UDG酶用于RT-qPCR或RT-PCR體系時(shí)，會(huì)干擾逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)嗎？
A: 可選用耐受性能良好的逆轉(zhuǎn)錄酶，如Hifair® V Reverse Transcriptase（Cat#11300ES）反應(yīng)溫度50-55℃，此時(shí)熱敏UDG酶活性極低。
Q5: UDG酶會(huì)切割RNA嗎？
A: 不會(huì)。在生物體內(nèi)，UDG酶在DNA修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。它可以修復(fù)dC脫氨基形成dU的突變，進(jìn)而避免GC堿基對(duì)突變?yōu)锳T堿基對(duì)的可能。
Q6: UDG酶反應(yīng)Buffer是什么？
A: UDG酶可以在各類緩沖液中發(fā)揮作用，如常規(guī)的Taq酶Buffer、連接酶Buffer、酶切Buffer等。
Q7: UDG酶對(duì)DNA鏈的堿基個(gè)數(shù)有要求嗎？
A: 不能從6堿基或更少的寡核苷酸上水解尿嘧啶。
【訂購指南】
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
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熱敏UDG |
10303ES |
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普通UDG |
10304ES |
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dUTP |
10128ES |
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dNTP |
10125ES |
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RT-qPCR用逆轉(zhuǎn)錄酶 |
11300ES |
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RT-qPCR用熱啟動(dòng)Taq酶 |
10717ES |
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RT-Lamp用逆轉(zhuǎn)錄酶 |
11111ES |
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RT-Lamp用Bst酶 |
14402ES |
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RNase抑制劑 |
10603ES |
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Taq酶單克隆雙封閉抗體 |
31303ES |
【注】：以上產(chǎn)品均有高濃度或無甘油產(chǎn)品，可做成凍干形式。詳情咨詢18186211438。
