大家好，我是你們的實(shí)驗(yàn)小助手小翌，上一期我們講到了細(xì)胞凋亡檢測(cè)的各種手段。這一期我們主要講TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)——分析實(shí)驗(yàn)中TUNEL染色結(jié)果失敗的原因。首先要先了解一下TUNEL染色步驟，如下圖所示。
圖1. TUNEL染色操作步驟（注：細(xì)胞核染色步驟可選）
用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程中，需要用到蛋白酶K、熒光素-dUTP、TdT酶等各種試劑。除此以外，還要設(shè)置陽性和陰性對(duì)照組，面對(duì)染色步驟繁瑣，許多人表示疑惑，下面我們就一一解答。
01
TUNEL試劑盒主要成分及功能
1）Equilibration緩沖液：用于維持一定的反應(yīng)條件，緩沖液中的Mg2+降低背景，Mn2+增強(qiáng)染色效果。
2）蛋白酶K（Proteinase K）：通透細(xì)胞膜和核膜，保證TUNEL探針進(jìn)入細(xì)胞中，保證染色充分。
3）熒光素-dUTP：標(biāo)記3'-OH末端和作為TdT酶的底物。
4）TdT酶：催化dUTP標(biāo)記3'-OH末端的關(guān)鍵酶。
02
陽性組、陰性組、實(shí)驗(yàn)組
1）陽性組：用DNase酶處理，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、暴露出3'-OH末端。每次實(shí)驗(yàn)做一個(gè)即可。
2）陰性組：不加TdT酶，其余操作和實(shí)驗(yàn)組相同。每種切片樣本各需要做一個(gè)陰性對(duì)照。比如有5個(gè)老鼠的肺組織切片樣本，那么就需要做5個(gè)陰性組。
3）實(shí)驗(yàn)組：除了陽性組和陰性組，所有的樣本均是實(shí)驗(yàn)組。
03
為什么設(shè)置陽性組、陰性組
1）陽性組：用來驗(yàn)證本次實(shí)驗(yàn)操作和試劑盒有無問題。
2）陰性組：a.排除細(xì)胞自身凋亡以及操作過程等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧?；b.調(diào)整拍攝曝光強(qiáng)度。
除此以外，大家或多或少會(huì)遇到染色結(jié)果異常，包括熒光信號(hào)弱、沒有熒光信號(hào)、假陽性高、熒光背景強(qiáng)等問題。染色失敗的原因主要包括樣本處理不當(dāng)、染色不充分、曝光時(shí)間過長等，可從以下幾個(gè)方面對(duì)癥分析。
04
熒光信號(hào)弱或沒有熒光信號(hào)
若已知細(xì)胞或者組織樣本處于細(xì)胞凋亡狀態(tài)，但是用TUNEL試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)偏弱或沒有信號(hào)。
4.1 樣本處理不當(dāng)
1）樣本切片太厚。建議適當(dāng)將切片切薄一點(diǎn)，便于染色。
2）脫蠟和水化不充分。建議脫蠟先60 ºC 20 min，再使用二甲苯兩次5-10 min；而水化用梯度乙醇從高到低濃度浸洗。
3）Proteinase K的孵育時(shí)間過短。優(yōu)化Proteinase K的孵育時(shí)間，常用時(shí)間10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。
4）Proteinase K濃度過低。建議蛋白酶K一般工作液濃度為20 μg/mL。
5）放置在-20 ºC保存較長時(shí)間的切片不新鮮，減低染色效率。建議使用新鮮切片。
4.2 染色操作不當(dāng)
6）染色時(shí)間過短。建議一般 37 ºC 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長至2 h，但要結(jié)合背景著色。
7）TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度過低。建議適當(dāng)提高TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度。
8）TdT酶失活。建議TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會(huì)導(dǎo)致TdT酶失活。
9）樣本干燥。加上TUNEL反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片/保鮮膜/濕盒中進(jìn)行，保證樣本均勻染色，又可防止反應(yīng)液干燥。
4.3 熒光檢測(cè)操作不當(dāng)
10）操作未避光。由于熒光易碎滅，建議標(biāo)記與檢測(cè)樣本時(shí)，載玻片要避光，觀察時(shí)要盡量快。
05
非特異性染色（假陽性高）
若已知細(xì)胞或者組織樣本依然處于活細(xì)胞狀態(tài)，但是用TUNEL試劑盒檢測(cè)，出現(xiàn)了非特異性染色，和處理過的熒光信號(hào)一樣強(qiáng)，甚至比陽性對(duì)照組熒光信號(hào)還要強(qiáng)。
5.1 樣本處理不當(dāng)
1）使用酸性或堿性固定液，導(dǎo)致DNA損傷。建議使用pH中性的固定液固定組織或者細(xì)胞。
2）固定液濃度過高，導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議使用4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。
3）固定時(shí)間過長，導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議控制固定時(shí)間在4 ℃放置25 min。
4）蛋白酶K處理時(shí)間過長，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)縮短處理時(shí)間。
5）蛋白酶K濃度過大，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)調(diào)整蛋白酶 K溶液濃度，一般工作液濃度為20 μg/mL。
5.2 染色操作不當(dāng)
6）TUNEL染色時(shí)間過長。建議一般是 37 ºC 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長至2 h，但要結(jié)合背景著色。
7）未充分清洗樣本。染色后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來避免切片的非特異性染色。
06
熒光背景強(qiáng)
6.1 染色操作不當(dāng)
1）TUNEL染色時(shí)間過長。建議染色時(shí)間適當(dāng)，一般是 37 ºC 孵育60 min，避免串色。
2）TUNEL染色液濃度過大。建議增大稀釋倍數(shù)，優(yōu)化濃度。
3) 使用試劑盒提供的二價(jià)陽離子優(yōu)化反應(yīng)，試劑盒中的Mg2+可降低背景，Mn2+可增強(qiáng)染色效果。
4）PBS未充分清洗樣本。在TUNEL反應(yīng)后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來避免切片樣本中殘留的染料。
6.2 熒光檢測(cè)操作不當(dāng)
5）曝光時(shí)間過長。建議調(diào)整曝光條件，先對(duì)陰性組調(diào)整到無背景光，然后用這個(gè)曝光條件去拍攝實(shí)驗(yàn)組（可以微調(diào)，但是不需要大調(diào)）。
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