2020年，疫情席卷全球，分子診斷技術(shù)站了在世界的舞臺中央。熒光PCR法作為新 冠病毒核酸檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，為新 冠病毒的檢測提供了有力保障。然而，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確、假陽性和假陰性等問題，也一度讓分子診斷技術(shù)備受爭議。深究原因排除人為操作因素外，歸根結(jié)底要考慮試劑盒的質(zhì)量問題。而新 冠檢測過程中的核心成分--擴(kuò)增模塊中的熱啟動酶，無疑是其中關(guān)鍵的一環(huán)。

市面上診斷試劑盒擴(kuò)增模塊中的酶基本上都是抗體法熱啟動酶，但實(shí)際樣本檢測中不同廠家的酶原料差異又很大。那為何選擇抗體法熱啟動酶作為IVD核心酶，其質(zhì)量如何評測，又如何篩選出高質(zhì)量的抗體法熱啟動酶?

熱啟動酶在IVD領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，很好的解決了常規(guī)型PCR技術(shù)因產(chǎn)生引物二聚體或錯配引起的非特異性擴(kuò)增等問題，大大提高了反應(yīng)的特異性，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測。目前市面上常見的熱啟動酶按熱啟動修飾方法主要分為化學(xué)法、配體法和抗體法等。這三種方法在原理上有所區(qū)別，也各有優(yōu)劣勢（見表1）。

表1. 熱啟動酶常見修飾方法優(yōu)劣勢比較

相比較而言，化學(xué)修飾物不能夠批量合成，而且需要較長的激活時間DNA聚合酶才能釋放酶活；配體修飾DNA聚合酶只在20-25°C效果較好，到40°C時，聚合酶的活性就被釋放出來，即酶活封閉效果不穩(wěn)定，特異性不好；而抗體修飾的熱啟動酶可以達(dá)到很好的封閉酶活的效果，即對應(yīng)的封閉效果最佳，且酶活釋放速度快，能大大降低PCR的反應(yīng)時間，因此是目前IVD市場上應(yīng)用最多的DNA聚合酶熱啟動改造方法。

Taq酶的酶活、擴(kuò)增效率、靈敏度、抗體封閉效果等都是抗體法熱啟動酶的主要評測指標(biāo)。
 

Taq酶活測定目前在分子診斷行業(yè)沒有固定的標(biāo)準(zhǔn)，不同廠家酶活標(biāo)定的方法不同，導(dǎo)致客戶使用中會出現(xiàn)較大的問題。一般測試方法是同位素的方法進(jìn)行測定。這種方法具有高靈敏性，但只能檢測聚合酶活性，有時候并不能反映出實(shí)際TaqMan探針的擴(kuò)增效果。TaqMan探針法qPCR除了需要Taq酶5'→3'聚合酶活性外，還需要檢測Taq酶的5'→3'外切酶活性。這就是常規(guī)Taq酶活性測定的缺陷。建議大家購買了特定公司的Taq酶之后需要用自己設(shè)計的引物探針進(jìn)行實(shí)際酶活的二次標(biāo)定，以減少應(yīng)用中的不確定性。翌圣生物除了做Taq酶5'→3'聚合酶活性檢測之外，還利用TaqMan的方法進(jìn)行5'→3'外切酶活性的標(biāo)定，減少了客戶實(shí)際應(yīng)用中的問題。

PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率與DNA聚合酶的性能密切相關(guān)。通常驗證擴(kuò)增效率是將模板稀釋成一系列濃度梯度進(jìn)行qPCR反應(yīng)，用模板初始量（或未知量樣品的稀釋倍數(shù)）的log值對每個稀釋樣品的Ct值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到斜率和R²值，擴(kuò)增效率通過公式E=10^-1/斜率^-1計算，若介于90~110%，表示擴(kuò)增正常。若＜90%，則可能qPCR整個反應(yīng)條件不適宜或引物設(shè)計不當(dāng)。

擴(kuò)增效率與酶的比活性有較大的關(guān)系。酶的純度越高，比活性相對就高，這樣可以減少非活性Taq酶與底物的結(jié)合，提高有效擴(kuò)增幾率。

Taq酶的靈敏度和很多方面都有很大的關(guān)系，除了上面提到的酶純度，還有一個方面是Taq酶和底物的親和性，如果親和性越高，靈敏度自然就會比較高。相比底物親和性較低的Taq酶就需要通過提高酶濃度，即增加單次反應(yīng)中的Taq酶的分子數(shù)來達(dá)到提高靈敏度的目的。這時試劑成本就會提高很多。翌圣生物通過篩選高親和性Taq突變體，保障了個位拷貝數(shù)檢出的靈敏度。

熱啟動Taq酶是提高PCR擴(kuò)增靈敏度和特異性的重要的因素之一。非熱啟動的Taq酶由于在試劑配制過程中，會有一定的活性，容易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，最終會導(dǎo)致靈敏度的降低。一個活性有效封閉的Taq酶對于qPCR的有效擴(kuò)增至關(guān)重要。翌圣生物通過高通量篩選抗體，獲得了高親和，易釋放的抗體，并開發(fā)了相關(guān)的檢測方法，保障了熱啟動Taq酶的高品質(zhì)。

1. 熔解曲線測定性法

設(shè)置非熱啟動組、抗體封閉組、和無聚合酶對照組，將模板和引物對加入SYBR Green染料法qPCR的反應(yīng)體系中，37℃孵育40 min，分別檢測熔解曲線。非熱啟動組顯示出有擴(kuò)增產(chǎn)物生產(chǎn)，而另外兩組是引物二聚體，沒有產(chǎn)物形成。這說明抗體封閉效果明顯。

圖1. Taq Antibody封閉效果熔解曲線

2. 熒光值定量法

一般通過對比非熱啟動組、抗體封閉組和無聚合酶對照組的熒光值高低判斷封閉效果。在50℃ 條件下進(jìn)行延伸，反應(yīng)后取產(chǎn)物，加入適量PicoGreen染色液染色混勻后，進(jìn)行熒光信號檢測。根據(jù)熒光值判斷熱啟動酶活封閉效果，進(jìn)一步計算封閉效率，一般認(rèn)為封閉效率大于90%即認(rèn)為封閉效果良好。

表2. 熱啟動酶抗體封閉效率檢測

備注：封閉效率=100% -（樣本熒光值-陰性熒光值）/（陽性熒光值-陰性熒光值）

生產(chǎn)合格的IVD試劑，一般是在原料控制、生產(chǎn)管理、質(zhì)檢管控和倉儲運(yùn)輸?shù)葞讉€環(huán)節(jié)嚴(yán)格把控，層層把關(guān)。而抗體法熱啟動酶作為IVD試劑的核心原料，生產(chǎn)高質(zhì)量的抗體法熱啟動酶主要考慮其中兩個核心組分：封閉用抗體和DNA聚合酶。因此在原料把控、生產(chǎn)管理、質(zhì)檢管控和倉儲運(yùn)輸?shù)确矫嬉残枰髦稚鳌?/span>

產(chǎn)品質(zhì)量控制嚴(yán)格遵循“三重防護(hù)”：中間原料質(zhì)檢，成品自檢留樣、成品抽檢管控?？贵w法熱啟動酶生產(chǎn)后的質(zhì)控環(huán)節(jié)，主要在核酸酶殘留檢測、大腸桿菌檢測、DNA擴(kuò)增能力測試和抗體法熱啟動酶酶活封閉效果檢測等方面，同時在不同批次的穩(wěn)定性把控方面堅持質(zhì)量問題“零容忍”。

遵循模塊化倉儲，冷鏈運(yùn)輸原則。
 

翌圣生物作為長期專注于分子酶原料及建庫試劑盒等產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)的國家高新技術(shù)企業(yè)，依托長期儲備的分子酶雙向改造技術(shù)、蛋白發(fā)酵純化技術(shù)和高效抗體篩選技術(shù)平臺，翌圣生物酶原料可應(yīng)用于IVD分子診斷、治療領(lǐng)域。

不僅可提供抗體法熱啟動酶和封閉用Taq酶抗體和Taq酶5'→3'外切酶單克隆抗體，也可提供包括RT-PCR檢測試劑盒組裝用的核心試劑和所需的一系列關(guān)鍵分子酶原料，包括抗體法Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑和UDG酶/dUTP等。

HB210617