瑞典當(dāng)?shù)貢r(shí)間10月7日，2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了法國(guó)科學(xué)家Emmanuelle Charpentier和美國(guó)科學(xué)家Jennifer A. Doudna，以表彰其“開(kāi)發(fā)了一種基因組編輯的方法”，闡述和發(fā)展了CRISPR基因編輯技術(shù)。
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas9 ) 即成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列與Cas9蛋白組成的系統(tǒng)是細(xì)菌抵御外來(lái)病毒侵染的免疫系統(tǒng)?，F(xiàn)代生物學(xué)已將CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛應(yīng)用在基因編輯領(lǐng)域，是繼鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)等技術(shù)后最為重要的基因改造技術(shù)，可以在基因敲入、基因敲除、基因激活、基因沉默、表觀遺傳修飾及3D基因結(jié)構(gòu)改變中進(jìn)行廣泛的應(yīng)用[1]。
圖1. The three stages of the CRISPR/Cas bacterial adaptive immune system: acquisition, crRNA biogenesis and interference of viral DNA[2]
CRISPR/Cas9的應(yīng)用
1、 藥物靶點(diǎn)的確定與驗(yàn)證
2、 基因環(huán)路上下游調(diào)控機(jī)制分析
3、 代謝通路調(diào)節(jié)機(jī)制分析
4、 LncRNA作用機(jī)制分析
CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是包含單鏈RNA的sgRNA用與sgRNA的5'端互補(bǔ)的序列將Cas9蛋白引導(dǎo)至目標(biāo)DNA位點(diǎn)。Cas9 Nuclease 對(duì)目標(biāo)DNA序列的PAM依賴性識(shí)別并在PAM區(qū)上游3bp的特定位點(diǎn)啟動(dòng)DNA切割。Cas9 Nuclease 生成的雙鏈斷裂可通過(guò)NHEJ（Non-homologous end joining）或HDR（Homology directed repair）修復(fù)，NHEJ修復(fù)通常導(dǎo)致indel突變和基因失活，而HDR可以在提供供體模板時(shí)實(shí)現(xiàn)高保真的精確基因組編輯。由于生物體具有自我修復(fù)機(jī)制，隨著細(xì)胞復(fù)制分裂并修復(fù)切口，在修復(fù)的過(guò)程可能產(chǎn)生錯(cuò)配，移碼突變、缺失突變，最后篩選出錯(cuò)配純合子。
圖2. An overview of CRISPR/Cas9 mediated genome editing[3]
CRISPR/Cas9 系統(tǒng)成功的關(guān)鍵包括
1）如何減少和避免脫靶：采用nick形式的Cas9加雙鏈sgRNA
2）sgRNA靶點(diǎn)的選擇：Cas9 Nuclease 切割位置在待修飾位點(diǎn)的30bp以內(nèi)，Z差保持在50bp以內(nèi)。
3）sgRNA品質(zhì)：sgRNA活性是影響KI的關(guān)鍵因素之一，因此需要提前驗(yàn)證其活性。
4）Cas9 Nuclease 形式的選擇：縮短Cas9蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存續(xù)時(shí)間，可以避免連續(xù)切割和脫靶，建議使用mRNA或蛋白形式的Cas9。若采用質(zhì)粒，需要確保其純度和濃度（建議大于1μg/μl）。
……
翌圣生物經(jīng)過(guò)匠心研發(fā)，開(kāi)發(fā)出的sgRNA體外合成試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設(shè)計(jì)的特異性DNA序列，可在單管反應(yīng)4小時(shí)內(nèi)獲得20-100μg具有功能的高品質(zhì)的sgRNA，具有合成效率高、品質(zhì)好、切除效率高等特點(diǎn)。
Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit測(cè)試數(shù)據(jù)
較高濃度的sgRNA關(guān)系到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效果成敗，因此只有加入高濃度的sgRNA方能對(duì)基因的編輯起較好效果。翌圣開(kāi)發(fā)出的sgRNA體外合成試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設(shè)計(jì)的特異性DNA序列，可在單管反應(yīng)4小時(shí)內(nèi)獲得20-100μg，完全滿足基因編輯的需要。
圖3. 不同時(shí)間的sgRNA的合成量
對(duì)于sgRNA Synthesis Kit不僅要滿足產(chǎn)量上的要求，還需要針對(duì)不同種類(lèi)的sgRNA合成也要達(dá)到相當(dāng)高的產(chǎn)量，方能滿足不同類(lèi)型基因的編輯需要，擴(kuò)大試劑盒的應(yīng)用范圍。翌圣sgRNA Synthesis Kit經(jīng)過(guò)多個(gè)種類(lèi)的sgRNA的合成，其產(chǎn)量也是很高，可以滿足實(shí)驗(yàn)所需，因此可以適應(yīng)多種基因的編輯需要。
圖4. 不同種類(lèi)的sgRNA的合成量
在影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯的效果成敗的關(guān)鍵因素中，合成的sgRNA的品質(zhì)也是關(guān)鍵一環(huán)。因?yàn)楹铣傻膕gRNA的純度（即品質(zhì)）不好，對(duì)編輯的效率會(huì)產(chǎn)生很大影響。翌圣sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA經(jīng)過(guò)安捷倫2100測(cè)定，其條帶明顯、單一，純度高，說(shuō)明品質(zhì)較高，對(duì)后續(xù)的編輯效率會(huì)有很大提升。
圖5. 合成的sgRNA的品質(zhì)（安捷倫2100測(cè)定）
最后，所合成的高品質(zhì)sgRNA是否有活性，需要實(shí)地測(cè)定才能發(fā)現(xiàn)其是否有活性，是否能夠與Cas9 Nuclease進(jìn)行組合達(dá)到編輯基因的目的。翌圣sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA與Cas9 Nuclease進(jìn)行組合體外切割靶DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所合成的sgRNA可以有效引導(dǎo)Cas9 Nuclease在特定位點(diǎn)切割并產(chǎn)生特定大小的DNA片段，因此具備活性。
圖6. sgRNA的剪切效率效果圖
翌圣生物提供您高品質(zhì)、高性價(jià)比的sgRNA合成試劑盒，讓您的CRISPR/Cas9科學(xué)研究及相關(guān)基因編輯應(yīng)用如虎添翼，共同為人類(lèi)的未來(lái)健康奉獻(xiàn)一份力量。
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40806ES02/03 |
0.5/1 mL |
【1】王晗月,楊曉菲,胡巢鳳,李富榮. CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在糖尿病細(xì)胞治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué),2019,07:723-73.
【2】Hryhorowicz M, Lipiński D, Zeyland J, S?omski R. CRISPR/Cas9 Immune System as a Tool for Genome Engineering. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2017;65(3):233-240. doi:10.1007/s00005-016-0427-5
【3】Lone BA, Karna SKL, Ahmad F, Shahi N, Pokharel YR. CRISPR/Cas9 System: A Bacterial Tailor for Genomic Engineering. Genet Res Int. 2018;2018:3797214. Published 2018 Sep 18. doi:10.1155/2018/3797214
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