隨著生物科技的發(fā)展，生物治療業(yè)已成為重要的前沿疾病治療技術(shù)，其中利用RNA體外合成技術(shù)制備的mRNA疫苗在2020年大爆發(fā)的COVID-19傳染病上產(chǎn)生了巨大的影響。很多公司如美國Moderna、德國CureVac、BioNTech等均已經(jīng)開展了其他疾病如腫瘤、傳染病、慢性病等治療性mRNA疫苗和藥物開發(fā)。
mRNA（Messenger RNA或信使RNA）在人類生物學(xué)中起著基本作用，它轉(zhuǎn)移存儲在DNA中的指令來制活細(xì)胞所需的蛋白質(zhì)。mRNA疫苗是將RNA在體外進(jìn)行相關(guān)的修飾后傳遞至機體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并產(chǎn)生蛋白抗原，從而導(dǎo)機體產(chǎn)生針對該抗原的免疫應(yīng)答，進(jìn)而擴(kuò)大機體的免疫能力[2,3]。mRNA疫苗分為非復(fù)制性mRNA(nonreplicating mRNA)和自擴(kuò)增mRNA(self-amplifying mRNA)兩類：自擴(kuò)增mRNA不僅編碼目標(biāo)抗原，而且還編碼能夠使細(xì)胞內(nèi)RNA擴(kuò)增和蛋白表達(dá)的復(fù)制機制。非復(fù)制性mRNA疫苗僅編碼目標(biāo)抗原并包含5′和3′非翻譯區(qū)（UTR），它們提供對適應(yīng)性和先天免疫力的綜合刺激，即原位抗原表達(dá)和危險信號傳遞。
mRNA疫苗開發(fā)流程包括病原體識別、測序、mRNA體外合成和修飾、純化等操作。
圖1. mRNA疫苗的示意圖及其抗原表達(dá)的機制[4] 
圖2. mRNA疫苗生產(chǎn)制備流程圖[5]
體外合成RNA（IVT）主要是以DNA為模板通過體外轉(zhuǎn)錄得到，常用的是以線性化質(zhì)粒DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板利用RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成。主要過程是利用含有T7啟動子（TAATACGACTCACTATAGGG）或SP6啟動子（ATTTAGGTGACACTATAG）序列的DNA為模板在含有T7或SP6 RNA聚合酶的條件下，以NTP為底物合成與模板DNA中一條鏈互補的mRNA，簡單快速獲得大量的mRNA分子，通過在5’端加上帽子結(jié)構(gòu)和3’端加ployA尾加強mRNA的穩(wěn)定性。
圖3. 體外轉(zhuǎn)錄（IVT）mRNA生產(chǎn)和裝配過程[6]
翌圣生物經(jīng)過匠心研發(fā)開發(fā)出的Hifair? T7 High Yield RNA Synthesis Kit高產(chǎn)量體外合成試劑盒包含一整套的RNA合成所需試劑，并配有詳細(xì)的教程。試劑盒可以合成長轉(zhuǎn)錄本以及短轉(zhuǎn)錄本，以1μg的模板投入量可以產(chǎn)生100-200 μg的RNA，適用于單鏈 RNA合成（包括siRNA等各類RNA前體及RNA探針）和以Cap analog為引物合成Capped mRNA。
? 產(chǎn)品特點
高產(chǎn)量：2h內(nèi)產(chǎn)生100-200μg，單次放大反應(yīng)可產(chǎn)生毫克級RNA
多功能: 適用于長片段和短片段RNA轉(zhuǎn)錄
靈活性: 可獲得無標(biāo)記、標(biāo)記以及加帽的RNA
? 測試數(shù)據(jù)
圖4. 不同長度轉(zhuǎn)錄-時間梯度電泳圖
圖5. 不同目的片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量
圖6. 不同目的片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物品質(zhì)
? 相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
10623ES50/60 | 50/100T |
由于RNA的穩(wěn)定性較弱，因此合成后的mRNA穩(wěn)定性是必須要重點關(guān)注的問題。通常需要通過在5’端加上帽子結(jié)構(gòu)和3’端加ployA尾加強mRNA的穩(wěn)定性。翌圣提供低殘留和高效加帽的Vaccinia Capping Enzyme（牛痘病毒加帽酶）是經(jīng)過GMP生產(chǎn)獲得，完全滿足疫苗生產(chǎn)所需，并提供其他相關(guān)的酶類和試劑。
? 產(chǎn)品特點
生產(chǎn)工藝：GMP工藝生產(chǎn)
殘留：無核酸酶、內(nèi)毒素含量低
來源：大腸桿菌重組表達(dá)
純度高：純度 >95%（SDS-PAGE）
比活：~160000U/mg(BCA)
? GMP級別質(zhì)檢
質(zhì)檢項目 | 蛋白酶 | 核酸外切酶 | 切口酶 | RNA酶 | 內(nèi)毒素 | 宿主蛋白 | 宿主核酸 | 無菌檢測 | 病原體 | 支原體 | … |
√ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
注：具體質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)及數(shù)據(jù)參考具體COA，病原體包括HBC/HCV/HIV，其他產(chǎn)品病原體檢測均是。
? 加帽效率
質(zhì)譜測定兩種酶的加帽效率，并與對照品的酶加帽效率進(jìn)行對比，可以發(fā)現(xiàn)翌圣的加帽效率比較高，獲得的產(chǎn)物的純度也較高。
? 殘留檢測
分別檢測Rnase、核酸酶、切口酶、大腸桿菌DNA殘留，經(jīng)檢測結(jié)果顯示，成品無相關(guān)酶的殘留，且表達(dá)的宿主DNA殘留也達(dá)到了要求標(biāo)準(zhǔn)。
? 相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
10614ES84/92/94 | 2000/10000/20000U |
合成后的產(chǎn)物可能會有DNA殘留，在疫苗開發(fā)階段，殘留的去除是關(guān)鍵的步驟，以減少下游純化難度并增加產(chǎn)品的純度。翌圣生物開發(fā)的DNase I是通過原核生物表達(dá)并經(jīng)過GMP工藝生產(chǎn)，滿足疫苗開發(fā)的需求。
? 產(chǎn)品特點
生產(chǎn)工藝：GMP工藝生產(chǎn)
殘留：無核酸酶、內(nèi)毒素含量低
來源：大腸桿菌重組表達(dá)
純度高：≥80% by Biuret
酶活：≥2000 Kunitz Units/mg protein
? GMP級別質(zhì)檢
質(zhì)檢項目 | 蛋白酶 | 核酸外切酶 | 切口酶 | RNA酶 | 內(nèi)毒素 | 宿主蛋白 | 宿主核酸 | 無菌檢測 | 病原體 | 支原體 | … |
√ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
注：具體質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)及數(shù)據(jù)參考具體COA
? 測試數(shù)據(jù)
圖7. RNAse殘留檢測
通過SDS-PAGE分析確定的DNase I（無RNase）純度約為95%。
圖8. DNase I（無RNase）純度檢測（SDS-PAGE）
? 相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
10611ES76/84 | 500/2000U |
在經(jīng)歷嚴(yán)格的合成及修飾后，所獲得的mRNA需要進(jìn)一步的純化以達(dá)到后續(xù)研究的純度標(biāo)準(zhǔn)。翌圣生物開發(fā)的mRNA純化磁珠是偶聯(lián)了Oligo（dT）的微米級順磁性微球。運用Oligo(dT)特異結(jié)合到mRNA上Poly(A)尾端，特異地將mRNA從總RNA中分離出來。
? 產(chǎn)品特點
高效率：mRNA純化在45min內(nèi)完成
高純度：Oligo(dT) 磁珠特異性吸附mRNA
靈活：兼容手動和自動化操作平臺
可靠：獲得的mRNA適用NGS、體外翻譯、RT-PCR和CDNA合成
? 純化效果好
使用磁珠純化擬南芥和小鼠肝組織RNA樣本，Hieff NGS? mRNA Isoaltion Beads的mRNA回收效率更高，rRNA的去除效果更好。
圖9. mRNA Isolation Kit純化不同RNA樣本中的mRNA 管家基因產(chǎn)量表征mRNA回收效果。rRNA相關(guān)基因產(chǎn)量表征rRNA去除效果
圖10. mRNA 純化操作流程
? 相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
12603ES24 /96 | 24/96T |
翌圣生物作為分子酶領(lǐng)域創(chuàng)新領(lǐng)導(dǎo)者，專注為您提供高品質(zhì)的分子酶產(chǎn)品及相關(guān)試劑盒，為您的科學(xué)研究和藥物及疫苗的開發(fā)提供更多選擇和方便，也為人類的未來健康事業(yè)奉獻(xiàn)一份力量。
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
10614ES84/92 | 2000/10000U | |
10612ES84/92 | 2000/10000U | |
10613ES92/97 | 10/50KU | |
10621ES10/20 | 10/20 KU | |
10620ES10/60 | 10/100U | |
UCF.ME? DNase I , RNase-free ，GMP-grade | 10611ES76/84 | 500/2000U |
10623ES50/60 | 50/100T | |
10619ES02 | 0.5ml | |
10132ES03 | 1ml | |
10133ES03 | 1 Set (4 vial) |
【1】Verbeke, Rein & Lentacker, Ine & De Smedt, Stefaan & Dewitte, Heleen. (2019). Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 100766. 10.1016/j.nantod.2019.100766.
【2】苗鶴凡, 郭勇, 江新香. mRNA疫苗研究進(jìn)展及挑戰(zhàn)[J]. 免疫學(xué)雜志, 2016(05):446-449.
【3】Kramps T., Elbers K. (2017) Introduction to RNA Vaccines. In: Kramps T., Elbers K. (eds) RNA Vaccines. Methods in Molecular Biology, vol 1499. Humana Press, New York, NY.
【4】Verbeke, Rein & Lentacker, Ine & De Smedt, Stefaan & Dewitte, Heleen. (2019). Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 100766. 10.1016/j.nantod.2019.100766.
【5】Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,
【6】Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,
HB201226
