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導(dǎo) 讀
DNA甲基化（DNA methylation）是一種重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基上的化學(xué)修飾過程。
DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的核心組成部分，在基因的表達(dá)調(diào)控、正常細(xì)胞功能維持、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要作用。因此，明確甲基化位點(diǎn)對(duì)解析生命過程、探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展、開發(fā)新的抗腫瘤策略等方面具有重要的意義。
單堿基水平檢測(cè)甲基化是研究表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容。檢測(cè)DNA甲基化首先要進(jìn)行堿基轉(zhuǎn)換以區(qū)分甲基化與非甲基化位點(diǎn)，而基于重亞硫酸鹽bisulfite的轉(zhuǎn)化的BS-seq方法無疑是金標(biāo)準(zhǔn)。
Bisulfite轉(zhuǎn)化問題多
目前，基于重亞硫酸鹽bisulfite的轉(zhuǎn)化方法是在單堿基水平進(jìn)行甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。其利用bisulfite將DNA上未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變成U，通過PCR擴(kuò)增后測(cè)序鑒定甲基化位點(diǎn)。該方法C-U轉(zhuǎn)化效率高達(dá)99%，但是，bisulfite轉(zhuǎn)化方法存在致命的缺陷，主要包括以下幾點(diǎn)：
1 對(duì)于核酸的損傷極高（圖1），導(dǎo)致后續(xù)的文庫制備通常只能選擇以單鏈建庫為主的文庫制備方案，在珍稀樣品（如cfDNA）中應(yīng)用較少；
2 Bisulfite轉(zhuǎn)化后的文庫GC占比失衡，AT會(huì)過度測(cè)序，難以真實(shí)反應(yīng)樣本表觀修飾情況；
3 回收率極低，通常僅為10%左右。
甲基化轉(zhuǎn)化新選擇：TET酶
TET (Ten-eleven translocation)酶是生物體內(nèi)存在的一種α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+依賴的雙加氧酶，在靠近C端擁有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域DBSH，該結(jié)構(gòu)域具有金屬離子（Fe2+）和α-KG的結(jié)合位點(diǎn)，催化結(jié)構(gòu)域前還有一段富含半胱氨酸區(qū)。TET蛋白生物功能的發(fā)現(xiàn)為5mC的去甲基化機(jī)制提供了新的見解，該蛋白將5mC轉(zhuǎn)化為5hmC后，可繼續(xù)催化5hmC轉(zhuǎn)化為5fC和5caC，然后在TDG（胸腺嘧啶-DNA糖苷酶）的作用下生成C。在TET、TDG和DNMT的共同作用下，可實(shí)現(xiàn)DNA上同一位點(diǎn)的3種堿基類型C、5mC和5hmC動(dòng)態(tài)平衡（圖2）。
圖2.DNA甲基化和去甲基化的過程（Kao et al., 2016；J. Clin. Med.）
根據(jù)TET酶的作用原理，NEB推出的使用TET2通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)將5mC和5hmC氧化成5caC，5hmC在糖基化的作用下轉(zhuǎn)化成5ghmC，隨后利用脫氨酶APOBEC將C轉(zhuǎn)換成U、PCR擴(kuò)增后進(jìn)行甲基化位點(diǎn)鑒定（圖3B）。盡管該方法能夠減少DNA損傷，但與BS-seq類似，它也是將DNA上未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變成U，轉(zhuǎn)化后的文庫存在GC占比存在失衡等現(xiàn)象。
圖3.甲基化轉(zhuǎn)化原理流程對(duì)比
Liu（2019）等人開發(fā)出的DNA甲基化轉(zhuǎn)化方法采取的策略是將甲基化的C轉(zhuǎn)化成U，用以解決將未修飾的C轉(zhuǎn)換為U導(dǎo)致的序列復(fù)雜性降低、測(cè)序質(zhì)量差、定位效率低等問題。該方法使用NgTET1/mTET1將5mC和5hmC氧化成5caC、隨后5caC經(jīng)轉(zhuǎn)化劑處理轉(zhuǎn)化成U、PCR擴(kuò)增后用于建庫測(cè)序（圖3C）。相較于BS-seq，該方法具有對(duì)DNA的損傷小、覆蓋度更高等優(yōu)勢(shì)，為在單堿基分辨率下準(zhǔn)確的鑒定DNA甲基化位點(diǎn)提供新的思路。但該方法目前存在轉(zhuǎn)化效率偏低、而TET酶的活性很大程度上影響轉(zhuǎn)化效率。
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作為甲基化C轉(zhuǎn)化成U過程中最關(guān)鍵的酶TET，其活性的提高將有助于轉(zhuǎn)化效率的提升。翌圣生物長(zhǎng)期專注于分子酶產(chǎn)品的創(chuàng)新研發(fā)，通過對(duì)納氏蟲屬DNA雙加氧酶（NgTET1）進(jìn)行定向有理改造，獲得重組融合突變體蛋白eTET1，該酶的活性顯著高于NgTET1和mTET1（圖4）。
圖4.eTET1與其他TET酶活性比較
訂購(gòu)信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 |
12219ES60 | 50 μg | |
12219ES76 | 300 μg | |
12219ES80 | 600 μg |
參考文獻(xiàn)?
[1] Kao S H, Wu K J, Lee W H. Hypoxia, epithelial-mesenchymal transition, and TET-mediated epigenetic changes[J]. Journal of clinical medicine, 2016, 5(2): 24.
[2]
Liu Y, Siejka-Zielińska P, Velikova G, et al. Bisulfite-free direct
detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base
resolution[J]. Nature biotechnology, 2019, 37(4): 424-429.
