組蛋白作為染色體結(jié)構(gòu)的核心組分，在基因表達(dá)的影響方面作用較大，而其中影響最大的是組蛋白修飾的改變。而組蛋白修飾作為表觀組學(xué)重要研究?jī)?nèi)容之一，主要是通過不同的組蛋白修飾形成異染色質(zhì)或者常染色質(zhì)狀態(tài)，從而使得基因的表達(dá)呈現(xiàn)關(guān)閉或開放的狀態(tài)。
圖：組蛋白修飾的表觀調(diào)控
組蛋白可以發(fā)生各種各樣的修飾，像甲基化修飾、乙?；揎棥⒘姿峄揎?、泛素化修飾等，而目前在組學(xué)研究中，研究最為透徹的是H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3、H3K27ac、H3K36me3。不同的組蛋白修飾有不同的功能，同時(shí)在基因組上的位置分布也不同。常見的處于異染色質(zhì)區(qū)域作為基因沉默的marker的有H3K9me3、H3K27me3和H4K20me3，而處于常染色質(zhì)區(qū)域作為基因激活marker的有H3K4me3、H3K36me3和H3K79me3。
圖：染色體結(jié)構(gòu)圖
圖：不同組蛋白修飾在基因組中的位置分布
作為DNA-蛋白互作尤其是組蛋白修飾研究的新興技術(shù)，CUT&tag的出現(xiàn)引發(fā)了一波表觀熱潮。尤其是其屬于細(xì)胞內(nèi)的原位實(shí)驗(yàn)，相較于ChIP-seq來說，優(yōu)勢(shì)明顯。CUT&tag實(shí)驗(yàn)無需甲醛交聯(lián)（對(duì)于一些結(jié)合較弱的轉(zhuǎn)錄因子，可以進(jìn)行輕微甲醛交聯(lián)）和超聲片段化，這無疑降低了實(shí)驗(yàn)的門檻。同時(shí)，CUT&tag實(shí)驗(yàn)中，Tn5酶的應(yīng)用使得一步法建庫成為可能。該實(shí)驗(yàn)仍然利用了Tn5酶的特性，在轉(zhuǎn)座切割時(shí)，原位切割的DNA上會(huì)攜帶Tn5酶的核心序列。進(jìn)行文庫構(gòu)建步驟時(shí)，含有Tn5酶核心序列的接頭能夠直接連接和擴(kuò)增就能將目的蛋白特異性抗體靶向結(jié)合DNA序列直接擴(kuò)增成文庫，無需繁瑣的末修、加A和接頭連接等步驟。更重要的是，Tn5酶的使用，使得CUT&Tag能較好的應(yīng)用在高通量單細(xì)胞表觀研究中。目前已經(jīng)有成熟的偶聯(lián)含Tn5酶核心序列的Gel beads投入使用，我們進(jìn)行常規(guī)CUT&tag實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行單細(xì)胞捕獲環(huán)節(jié)，gel beads上的核心序列會(huì)與細(xì)胞內(nèi)特異性酶切DNA進(jìn)行偶聯(lián)，最后，通過常規(guī)的Tn5酶切建庫的方式進(jìn)行文庫擴(kuò)增，擴(kuò)增后的序列會(huì)攜帶barcode進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞CUT&tag研究。
圖：scCUT&tag實(shí)驗(yàn)流程，from Steven J. W. et al, 2021, Nature Biotechnology
在DNA-蛋白互作技術(shù)研究中，spike in的添加一直是一大傳統(tǒng)。當(dāng)然了，spike in的添加不僅僅只在DNA-蛋白互作技術(shù)研究中被應(yīng)用，常見的如RNA-seq中，也有大量報(bào)道進(jìn)行了spike in的添加。Spike in可以對(duì)樣本中真實(shí)基因的表達(dá)進(jìn)行校正，同時(shí)也能作為恒量實(shí)驗(yàn)好壞的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
圖：spike in的優(yōu)勢(shì)，F(xiàn)rom K.C et al. 2016
作為DNA-蛋白互作技術(shù)研究的金標(biāo)準(zhǔn)和老大哥，ChIP-seq實(shí)驗(yàn)中主要是添加外源的果蠅基因組用于spike in。而spike in的添加，能讓之前因PCR循環(huán)或測(cè)序偏好性影響而未檢測(cè)到的表達(dá)差異的基因在spike in normalization后，顯示出表達(dá)差異。
圖：ChIP-seq實(shí)驗(yàn)中spike in添加的優(yōu)勢(shì)
除了ChIP-seq外，CUT&RUN技術(shù)在研發(fā)報(bào)道時(shí)期，也是有spike in的添加。CUT&RUN進(jìn)行DNA-蛋白互作研究時(shí)，已所需樣本數(shù)較低引起轟動(dòng)，而spike in的添加，使得不同樣本投入量得結(jié)果顯示更真實(shí)，因?yàn)榧?xì)胞投入量更低，在特異抗體靶向捕獲時(shí)，獲得的reads數(shù)也會(huì)更低。傳統(tǒng)數(shù)據(jù)分析無法體現(xiàn)細(xì)胞低投入，而加入spike in后，不同細(xì)胞投入數(shù)，特異性捕獲的DNA reads數(shù)也不同。
圖：CUT&RUN實(shí)驗(yàn)中加入spike in優(yōu)勢(shì)
翌圣生物創(chuàng)造性的在CUT&tag實(shí)驗(yàn)中，傳承了spike in的優(yōu)勢(shì)，在CUT&tag實(shí)驗(yàn)中，加入三段不同長(zhǎng)度的lamda DNA組成spikein mix，恒量spike in的加入，讓你的qPCR結(jié)果不受投入量影響，定量更準(zhǔn)確。
圖：CUT&Tag實(shí)驗(yàn)中加入spike in
Spike in加入后，進(jìn)行文庫構(gòu)建，建庫前spikein-1：spikein-2：spikein-3=1：3：10，文庫構(gòu)建后，比例變化不大。對(duì)建庫前的spike in和建庫后的spike in進(jìn)行回歸方程計(jì)算，發(fā)現(xiàn)建庫前和建庫后的spike in呈現(xiàn)線性變化，R的平方值都達(dá)到0.99以上，表明spike in的加入，可以讓建庫后的DNA能夠進(jìn)行定量，且能定量回溯到建庫前DNA的含量。
說了這么多，spike in的優(yōu)勢(shì)你get到了么？
那么，你的CUT&tag實(shí)驗(yàn)中加spike in了嗎？
翌圣產(chǎn)品速遞
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 |
CUT&Tag建庫試劑盒 | Hieff NGS? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina? | 12598ES04/12/48 | 4 T/12 T/48 T |
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