DNA聚合酶是PCR反應(yīng)中不可或缺的組成部分，是參與DNA復(fù)制中的重要酶，被用在生物及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的各個(gè)研究方向上。PCR技術(shù)發(fā)明至今40多年的時(shí)間里，從早期被發(fā)現(xiàn)的Taq DNA聚合酶到現(xiàn)在，酶越來(lái)越多樣化。隨著新酶的發(fā)現(xiàn)和對(duì)舊酶的改造，DNA聚合酶的保真性、特異性、靈敏度等都獲得了明顯的改進(jìn)。而高保真DNA聚合酶的出現(xiàn)正是順應(yīng)了市場(chǎng)需求，下面小編將圍繞高保真DNA聚合酶的作用原理和應(yīng)用方向等進(jìn)行介紹。
圖1. PCR擴(kuò)增的整個(gè)檢測(cè)過(guò)程[1]
什么是高保真酶
高保真DNA聚合酶有聚合中心和酶切中心，聚合中心具有5'→3'的DNA聚合酶活性，可沿 5'→3'方向催化合成 DNA；酶切中心具有3'→5'外切酶活性，可以進(jìn)行堿基錯(cuò)配的修復(fù)。常見的高保真DNA聚合酶類型有Pfu、KOD等。
圖2. DNA聚合酶的作用原理[2]
如何選擇高保真酶
對(duì)于測(cè)序、基因功能研究、蛋白表達(dá)、定點(diǎn)突變等，高保真性的擴(kuò)增是非常重要的，可以確保各種擴(kuò)增子的可靠擴(kuò)增。以測(cè)序文庫(kù)擴(kuò)增過(guò)程為例，測(cè)序過(guò)程中的突變會(huì)給序列拼接造成困難，甚至?xí)蓴_某些需要低頻檢測(cè)的分析結(jié)果。對(duì)于市場(chǎng)上琳瑯滿目的各種高保真DNA聚合酶，選擇一款合適的酶產(chǎn)品是極為必要的。市面上常見的高保真酶特性主要包含保真度、擴(kuò)增速率、特異性、是否耐U等。
保真度：錯(cuò)配率是計(jì)算高保真DNA聚合酶保真性的一個(gè)通用標(biāo)準(zhǔn)，錯(cuò)配率越低代表其保真性越好，保真度常用錯(cuò)配率的倒數(shù)表示（保真度=1/錯(cuò)配率），不同的測(cè)定方法也會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。常見的測(cè)定方法有以下三種：
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檢測(cè)方法 |
檢測(cè)原理 |
優(yōu)缺點(diǎn) |
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藍(lán)白斑篩選測(cè)定 |
利用DNA聚合酶擴(kuò)增lacZ基因，它可以還原β-半乳糖苷酶基因活性并產(chǎn)生藍(lán)色菌落，結(jié)合藍(lán)白斑篩選的結(jié)果可以評(píng)估保真度。 |
快速、相對(duì)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)有效；但是精確度不高，無(wú)法區(qū)分DNA的同義突變。 |
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一代測(cè)序 |
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至相應(yīng)的載體中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化后的單菌落進(jìn)行Sanger測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果中錯(cuò)配的核苷酸數(shù)進(jìn)行分析其保真度。 |
精確度高，可以檢測(cè)到所有的突變，但是工作量和成本都比較高。 |
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NGS測(cè)序 |
使用NGS平臺(tái)，將PCR擴(kuò)增后的經(jīng)相應(yīng)處理后的文庫(kù)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，從而計(jì)算DNA聚合酶擴(kuò)增過(guò)程中的保真度。 |
精確度高，可以檢測(cè)到DNA突變。但是測(cè)序平臺(tái)本身有一定的錯(cuò)誤率，且讀長(zhǎng)受限較大。 |
翌圣有多款表現(xiàn)穩(wěn)定的高保真DNA聚合酶。其中，Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase（Cat#10153，簡(jiǎn)稱Canace plus） 具有一流的保真度，其保真性是Taq酶的83倍，Pfu酶的9倍。
圖3. Canace plus的保真度
擴(kuò)增速率：合成能力是評(píng)估高保真DNA聚合酶非常重要的因素。原始的高保真DNA聚合酶因?yàn)榫哂休^強(qiáng)的3'→5'外切酶活性，其合成能力較低。例如Pfu DNA聚合酶的合成速率還不到Taq DNA聚合酶的一半，但是翌圣Canace系列高保真酶，通過(guò)基因改造，聚合能力明顯提升，Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase（Cat#10153，簡(jiǎn)稱Canace plus）擴(kuò)增速率可至10 sec/kb。
圖4. Canace plus的擴(kuò)增速率低至10 sec/kb。Canace plus分別擴(kuò)增水稻gDNA 2 kb片段和小鼠gDNA 4 kb，模板投入量50 ng，35個(gè)循環(huán)，M：1 kb DNA Marker。
特異性：PCR擴(kuò)增由低溫上升至高溫的過(guò)程中，酶的弱活性極易造成錯(cuò)配或形成引物二聚體，這種非特異性擴(kuò)增會(huì)顯著降低產(chǎn)物質(zhì)量。為了減少這種現(xiàn)象的發(fā)生，可以人為的在開始延伸之前不讓酶發(fā)揮活性，以保證擴(kuò)增的特異性，這種方式也被形容為酶的熱啟動(dòng)。Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase(Cat#10153)具備熱啟動(dòng)特性，具有特異性高、靈敏性高、產(chǎn)量高的特點(diǎn)。
圖5. Canace plus擴(kuò)增性能好。分別采用Canace plus(A)和市售高保真酶（競(jìng)品1-B、競(jìng)品2 -C）擴(kuò)增小鼠gDNA 4 kb，M：1 kb DNA Marker。
是否耐U：Pfu校正DNA聚合酶不能兼容dUTP，需要經(jīng)過(guò)特殊改造后方可耐受尿嘧啶，然后才能應(yīng)用甲基化文庫(kù)構(gòu)建或者定點(diǎn)突變等。Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase(Cat#10145)是翌圣針對(duì)含尿嘧啶模板設(shè)計(jì)的高保真DNA聚合酶，根據(jù)其甲基化文庫(kù)產(chǎn)量，可以看出其擴(kuò)增性能非常好。
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樣本種類 |
甲基化文庫(kù)構(gòu)建 |
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耐U高保真聚合酶(加入相同單位) |
Yeasen |
K* |
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Input DNA (ng) |
4.5 |
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擴(kuò)增循環(huán)數(shù) (cycles) |
7 |
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平均產(chǎn)量(ng) |
26.3 |
17.9 |
翌圣高保真DNA聚合酶選擇指南
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
主要應(yīng)用 |
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超高保真 |
10153ES |
分子克隆 |
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擴(kuò)增含U模板 |
10145ES |
甲基化模板擴(kuò)增 |
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高效率高保真 |
Hieff Canace® Pro High-Fidelity DNA Polymerase |
13476ES |
高通量測(cè)序 |
Q&A
1. Q：高保真DNA聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)物為平末端，TA克隆（或二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建）如何在產(chǎn)物末端加A？
A：Taq DNA聚合酶(Yeasen Cat#13486)具有的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性可以在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個(gè)核苷酸“A”，反應(yīng)體系和實(shí)驗(yàn)條件可參照相應(yīng)產(chǎn)品說(shuō)明書。
2. Q：不同的高保真DNA聚合酶產(chǎn)品保真度有可比性嗎？
A：不同公司測(cè)定保真度的方法不同，產(chǎn)生的結(jié)果也不一樣，酶的保真度必須采用同種方法下才能夠相互比較。
看到這里，您現(xiàn)在對(duì)高保真酶的信息都了解了嗎？如果有其他疑問(wèn)，可以聯(lián)系我們或者咨詢相應(yīng)負(fù)責(zé)地區(qū)技術(shù)人員。
參考文獻(xiàn)
1. Hu M, Jex A R, Campbell B E, et al. Long PCR amplification of the entire mitochondrial genome from individual helminths for direct sequencing.[J]. Nature Protocols, 2007, 2(10):2339-2344.
2. Loeb L A, Jr R. DNA polymerases and human disease[J]. Nature Reviews Genetics.
3. Steitz, T. A. DNA Polymerases: Structural Diversity and Common Mechanisms[J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(25):17395-8.
4. Minor variant detection in amplicons using 454 massive parallel pyrosequencing: experiences and considerations for successful applications.[J]. BioTechniques, 2011.
5. Lundberg K S, Dan D S, Adams M, et al. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus.[J]. Gene, 1991, 108(1):1.
