Spike in作為NGS實驗的校正工具，在NGS技術中早早就有應用，像常見的RNA-seq中就有spike in。當然，最初，spike in是由ERCC（External RNA Control Consortium）RNA外部質控組織為RNA-seq開發(fā)的，以標化不同樣本之間的RNA counts（通過與已知濃度的對照進行比對，借助RNA測序的方法對基因表達進行定量分析）。
在DNA-蛋白互作領域，spike in也被借鑒。像傳統(tǒng)的DNA－蛋白互作技術ChIP-seq中引入果蠅基因組作為spike in來校正實驗。當然，spike in引入后，效果也是十分明顯的。spike in添加后，之前因PCR循環(huán)或測序偏好性影響而未檢測到的表達差異基因在spike in normalization后，顯示出明顯的表達差異。
圖1.ChIP-seq實驗中spike in添加的優(yōu)勢（From David A et al. 2014. Cell Reports）
作為DNA-蛋白互作尤其是組蛋白修飾研究的新興技術，CUT&tag的出現(xiàn)引發(fā)了一波表觀熱潮。尤其是其屬于細胞內的原位實驗，相較于ChIP-seq來說，優(yōu)勢明顯。CUT&tag實驗無需甲醛交聯(lián)（對于一些結合較弱的轉錄因子，可以進行輕微甲醛交聯(lián)）和超聲片段化，這無疑降低了實驗的門檻。CUT&tag實驗利用了Tn5酶的特性，在轉座切割時，原位切割的DNA上會攜帶Tn5酶的核心序列。進行文庫構建步驟時，含有Tn5酶核心序列的接頭能夠直接連接和擴增就能將目的蛋白特異性抗體靶向結合DNA序列直接擴增成文庫，無需繁瑣的末修、加A和接頭連接等步驟。
更重要的是，Tn5酶的使用，使得CUT&Tag能較好的應用在高通量單細胞表觀研究中。目前已經(jīng)有成熟的偶聯(lián)含Tn5酶核心序列的Gel beads投入使用，我們進行常規(guī)CUT&tag實驗后，進行單細胞捕獲環(huán)節(jié)，gel beads上的核心序列會與細胞內特異性酶切DNA進行偶聯(lián)，最后，通過常規(guī)的Tn5酶切建庫的方式進行文庫擴增，擴增后的序列會攜帶barcode進行細胞標記，從而實現(xiàn)單細胞CUT&tag研究。
圖2.scCUT&tag實驗流程，from Steven J. W. et al, 2021, Nature Biotechnology
Spike in在CUT&tag實驗中進行實驗校正，也是得到了CUT&tag實驗流程的創(chuàng)造者Henikoff實驗室的認可，Henikoff實驗室也提供了spike in的標準分析流程。
翌圣生物創(chuàng)造性得在CUT&tag實驗中，傳承了spike in的優(yōu)勢，在CUT&tag實驗中，加入三段不同長度的λDNA組成spike-in mix，恒量spike in的加入，讓你的qPCR結果不受投入量影響，定量更準確。
圖3.翌圣CUT&Tag試劑盒中spike in的測序結果
Spike in加入后，進行文庫構建，建庫前spikein-1：spikein-2：spikein-3=1：3：10，文庫構建后，比例變化不大。對建庫前的spike in和建庫后的spike in進行回歸方程計算，發(fā)現(xiàn)建庫前和建庫后的spike in呈現(xiàn)線性變化，R的平方值都達到0.99以上，表明spike in的加入，可以當作內參讓建庫后的DNA能夠進行標準化校正。
CUT&tag實驗中的spike in存在，優(yōu)勢廣泛，它可以更準確的校正樣本測序的reads，讓樣本間的差異直觀的展示。
圖4.不同投入量細胞的spike in校正
從上圖可以看到，不同投入量的細胞在實驗室，捕獲到的測序reads是有差異的，引申來看，同一樣本，不同處理間，也會出現(xiàn)這種差異，使用同一標準的spike in校正后，微弱差異的reads或者說微弱差異基因的信息才不會被測序等因素影響而淹沒。
除了生信分析層面的差異，CUT&tag-qPCR也是很多老師會選擇的實驗方式，在CUT&tag-qPCR中，spike in的存在也是優(yōu)勢十足。
圖5.不同投入量細胞的CUT&tag-qPCR spike in校正的結果
CUT&tag-qPCR時，用spike in校正后，可以很明顯看到，如果沒有spike in校正，不同投入量細胞進行CUT&tag實驗，同一基因qPCR后富集倍率差異較大，但是spike in校正后，基因的富集倍率受投入量影響較少。另外，在CUT&tag實驗中，一些低富集的基因，可能因實驗因素導致CUT&tag-qPCR顯示不富集，但是spike in校正后，低富集的基因顯示出富集，并且真實展示了該基因確實是低富集。
當然，在CUT&tag實驗中，spike in添加后，會在文庫中呈現(xiàn)出來，大家如果碰到文庫中有明顯的400多bp大小的片段，一定不要驚訝為什么（spike in 3長度300 bp，再加上測序接頭138 bp左右，大小就在400多bp）。
圖6.CUT&tag實驗陰性對照組IgG組spike in的文庫峰
翌圣CUT&tag試劑盒，已經(jīng)成功在不同的樣本中以及不同的抗體中實驗，下面展示一些客戶的真實案例：
人外周血（H3K4me1） 人腫瘤組織（H3K4me1）
人腫瘤組織（H3K27ac） 人腫瘤組織（JUN）
桃果實（H3K27ac） HEK293細胞（GFP）
293T細胞（H3K27me3） U251MG細胞（H3K27me3）
Hela S3細胞（RNA polymerase II） 小鼠肝（H3K27me3）
HUH6細胞（β-Catenin） A549（BDR4）
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 編號 | 規(guī)格 |
CUT&Tag建庫試劑盒 | Hieff NGS??G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina? | 12598ES04/12/48 | 4 T/12 T/48 T |
接頭 | 12610ES96 | 96 index |
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