氧化應(yīng)激（oxidative stress）是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧（reactive oxygen species,ROS）和活性氮（reactive nitrogen species,RNS）自由基產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)動態(tài)失衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷的一種狀態(tài)。研究表明機(jī)體內(nèi)氧化還原水平失衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是眾多疾病的病理生理基礎(chǔ)，防御氧化應(yīng)激，主要依靠機(jī)體內(nèi)的抗氧化體系。根據(jù)清除機(jī)制的不同，抗氧化體系大致可分為兩個(gè)系統(tǒng)：酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)。

體系內(nèi)各種抗氧化大分子、小分子和酶的總水平，反映了該體系內(nèi)的總抗氧化能力（T-AOC）。T-AOC能更全面地評價(jià)體液、細(xì)胞和組織勻漿、食品和飲料的抗氧化劑含量，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等相關(guān)研究。

圖1 自由基和抗氧化劑之間的不平衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激（圖源百度）

即二苯基苦基苯肼，DPPH是一種穩(wěn)定的氮中心顯色自由基，在517nm波長處產(chǎn)生特征吸收峰。樣本中的抗氧化物質(zhì)會使DPPH的吸光度減小直至消失，其吸光度的變化量在一定區(qū)間內(nèi)與抗氧化物質(zhì)含量呈線性關(guān)系。

即2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，又稱TEAC法，ABTS與適當(dāng)氧化劑作用后，會生成藍(lán)綠色的ABTS陽離子自由基（ABTS•+），在734nm波長處產(chǎn)生特征吸收峰，當(dāng)抗氧化物質(zhì)存在時(shí)，ABTS•+的生成會受到抑制，使吸光度降低。與Trolox標(biāo)準(zhǔn)對照體系相比較，就能計(jì)算出樣本的總抗氧化能力（TEAC值）。

即FRAP法（ferric reducing antioxidant power），即在酸性條件下，Fe3+-TPTZ被樣本中的抗氧化物質(zhì)還原為藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，并在593nm波長處產(chǎn)生特征吸收峰。以Fe2+為標(biāo)準(zhǔn)，通過吸光度的大小，可以計(jì)算樣本的抗氧化能力。FRAP法測定步驟簡單，速度快，但其本質(zhì)是以Fe2+進(jìn)行等量替代的計(jì)算方法，反應(yīng)本身并不具備抗氧化能力的生物學(xué)相關(guān)性。

抗氧化能力的評價(jià)方法，因檢測原理、反應(yīng)條件等的不同而多種多樣，每一種方法都有其適用范圍和特點(diǎn)。

目前，還沒有哪一種方法能夠全面地評價(jià)出樣本的總抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)中，往往需要至少兩種方法同時(shí)測定。對于具體樣本，應(yīng)根據(jù)分析條件和作用底物等因素，綜合選擇相應(yīng)的檢測方法。

DPPH法、FRAP法和 ABTS法較為簡便易行，但DPPH、ABTS的化學(xué)性質(zhì)使其偏離生物環(huán)境較遠(yuǎn)；FRAP法和ABTS法在結(jié)果上具有很好的相關(guān)性與一致性，尤其是在成本和操作上，具有明顯的比較優(yōu)勢。

1. DPPH反應(yīng)液配制：準(zhǔn)確稱取0.0039 g DPPH試劑（Yeasen Cat.NO 60310ES）溶于乙醇中，室溫避光下攪拌2 h，定容至100 mL^[1]；

2. 檢測方法：將樣品與DPPH以1：9的體積比混勻，室溫避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測定吸光值；

3. 結(jié)果表示：以Trolox（Yeasen Cat.NO 60309ES）當(dāng)量測定抗氧化能力。

1. ABTS反應(yīng)液配制：ABTS（Yeasen Cat.NO 60328ES）溶于pH值為4.5的醋酸鈉溶液中配制7.4 mmol/L的ABTS溶液，并將ABTS與2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液以1：1體積比混勻，室溫下避光靜置12 h^[2] ；

2. 檢測方法：將樣品與反應(yīng)液以1：9的體積比混勻，避光反應(yīng)30 min后，734nm檢測吸光度；

3. 結(jié)果表示：以Trolox（Yeasen Cat.NO 60309ES）當(dāng)量測定抗氧化能力。

1. FRAP反應(yīng)液配制：將TPTZ（Yeasen Cat.NO 60329ES）溶于40 mmol/L HCl 配制7 mmol/L的A工作液，并分別制備20 mmol/L的FeCl3（B工作液）和300 mmol/L的pH為3.6醋酸鈉溶液（C工作液），將A: B: C體積比為10:1:1混勻得FRAP工作液。

2. 檢測方法：配制濃度為0.031~4mM的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。將各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液與工作液分別以1：29的體積比混勻，避光反應(yīng)15 min后，在593 nm處測定吸光值，繪制吸光值與FeSO4濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。  

3. 結(jié)果表示：將樣品與FRAP反應(yīng)液混勻后測定其吸光值，樣品的FRAP自由基清除能力用FeSO4當(dāng)量濃度表示^[3]。

[1] Hui T,et al.Food and Chemical Toxicology.129(2019)138-143. 

[2] Leyla Pa,sayeva,et al.Antioxidants 2022, 11, 2284.

[3] Thaina Omia Bueno-Pereira,et al.Antioxidants 2022,11,2111.