小鼠小腸類器官構(gòu)建寶典
類器官（organoids）是指利用干細(xì)胞、祖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等在體外培養(yǎng)出的3D細(xì)胞培養(yǎng)物并具有一定的空間結(jié)構(gòu)組織類似物。2021年，類器官技術(shù)被列為“十四五”國家重點研發(fā)專項，作為疾病模型，相比于傳統(tǒng)2D疾病模型，類器官在闡明疾病的發(fā)展、穩(wěn)態(tài)性和發(fā)病機理等與體內(nèi)環(huán)境更加接近，在多領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要，諸如細(xì)胞治療、藥物研發(fā)、基因工程、免疫研究、組織再生等領(lǐng)域。
以下內(nèi)容小翌將通過講述小鼠小腸類器官培養(yǎng)的全過程及相關(guān)注意事項為大家在培養(yǎng)過程中減少踩坑概率。
實驗所需材料
|
應(yīng)用方向 |
材料名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
|
腸組織消化 |
41423ES |
30ml |
|
|
84702ES |
70um |
||
|
耗材設(shè)備 |
84003ES |
100mm |
|
|
83503ES/83505ES |
1.5ml/15ml |
||
|
84503ES |
5ml |
||
|
類器官培養(yǎng)支持 |
Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠 |
40191ES |
5 mL |
|
培養(yǎng)基成分及添加劑 |
41420ES |
500ml |
|
|
41403ES |
500ml |
||
|
60126ES |
100g |
||
|
36100ES |
25g |
||
|
92278ES |
100ug |
||
|
92528ES |
100ug |
||
|
92708ES |
100ug |
||
|
92276ES |
100ug |
||
|
50303ES |
1g |
||
|
60117ES |
100ml |
||
|
60701ES |
100ml |
||
|
60704ES |
10ml |
||
|
60706ES |
5ml |
||
|
類器官收集 |
41421ES |
30mL |
|
|
類器官凍存 |
41422ES |
30mL |
小腸類器官培養(yǎng)步驟
樣本制備：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌環(huán)境下截取出近胃端處3~15cm腸組織，用鑷子小心去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預(yù)冷的含1%雙抗的DPBS溶液中。
樣本清洗：使用注射器沖洗腸道2-3次，用手術(shù)剪將腸管小心剪開，腸腔面朝上，手使用手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后（呈現(xiàn)組織透明），將腸組織置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗2~3次。
樣本初處理：將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬大小塊狀體，順勢轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管中，用DPBS輕柔清洗3-5次，除去腸絨毛細(xì)胞和漂浮脂肪組織。
樣本消化：在清洗好的小腸碎片組織加入10-15ml含有3-5mM EDTA的預(yù)冷 DPBS 中消化，4℃孵育 30min左右，期間每10min輕搖一次離心管。
消化完成后，棄去EDTA消化液上清，用新的DPBS緩沖液將組織輕柔漂洗2~3次以去除剩余的EDTA。
在小腸組織碎片中加入10~15ml預(yù)冷的含0.1%BSA的DPBS，反復(fù)吹打、重懸組織碎片，使隱窩與基底層分離，然后取少許懸液鏡檢，當(dāng)看有大量隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液使用70μm濾網(wǎng)過濾并收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液。
重復(fù)步驟5-6兩次，1500rpm、4℃離心 3min。
混合物形成：用Ceturegel®基質(zhì)膠重懸隱窩組織沉淀，每10μL基質(zhì)膠懸液包含200~600個隱窩，重懸后混合液置于冰上，盡快操作以避免基質(zhì)膠形成凝膠。
注意：基質(zhì)膠稀釋比例≥50%以保證培養(yǎng)過程中Ceturegel®基質(zhì)膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
將混合懸液種植于24孔板底部正中央，每孔30~50μL左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。
將種植后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30min左右待基質(zhì)膠凝固。
待Ceturegel®基質(zhì)膠完全凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的腸類器官培養(yǎng)基，每孔 800μL/孔。
將 24 孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基并監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，一般小鼠小腸類器官在5~7天內(nèi)形成。
實驗結(jié)果
圖.小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)結(jié)果圖
小腸類器官的傳代
培養(yǎng)5~7d或小腸類器官中央變黑時可進行傳代，提前將24或12孔板放于培養(yǎng)箱中孵育至少30min。吸走待傳代的培養(yǎng)液，加1mL/孔冷的DPBS，1min后挑起基質(zhì)膠，用1mL槍頭將基質(zhì)膠輕輕吹散，用注射器一次性吸走懸液，重復(fù)操作1次，將懸液加入5mL離心管中，1200r/min，4℃、5min離心，棄上清，按每孔1∶3傳代。
小腸類器官的凍存
選擇生長狀態(tài)旺盛的類器官(一般傳代后3~4d)，進行凍存，每兩孔凍存一管。吸去培養(yǎng)液，加入1mL細(xì)胞凍存培養(yǎng)液，用槍頭將加入類器官回收液的基質(zhì)膠吹散，后將懸液加到細(xì)胞凍存管中，放于凍存盒中，于-80℃冰箱放置1d，后轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
小腸類器官的復(fù)蘇
將24孔板放于培養(yǎng)箱預(yù)熱30min。取出液氮中的凍存管并置于37℃水浴鍋中，當(dāng)凍存液溶解時取出，用1mL注射器抽吸一次，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，1200r/min、4℃，離心5min，棄上清，加入5mL冰DPBS重懸，重復(fù)上述離心步驟，棄上清。按照類器官培養(yǎng)的步驟鋪板和培養(yǎng)。
消化組織選擇什么消化液，消化時長是多少？
組織的消化液可以選用EDTA或膠原酶，如果消化空腔性器官EDTA適合，如小腸和胃；膠原酶有不同類型，消化的組織類型比較廣泛，可以搭配DNA酶一起。不同組織消化時間差異比較大，從十幾分鐘到數(shù)小時。
不同孔板培養(yǎng)類器官培養(yǎng)所需的基質(zhì)膠和培養(yǎng)基體積?
培養(yǎng)類器官常用的是24孔板培養(yǎng)，按50μl/孔形成膠滴，再加入500μl培養(yǎng)基覆蓋膠滴；96孔板按10μl/孔形成膠滴，再加入200μl培養(yǎng)基覆蓋膠滴；6孔板每孔可以種植多個50μl膠滴，加入2~3ml培養(yǎng)基覆蓋膠滴。
|
類型 |
貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
應(yīng)用方向 |
|
即用型 3-6 mg/ml |
40182ES |
適應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)、貼壁、侵襲和遷移實驗以及細(xì)胞分化等研究 |
|
|
基本濃度 8-12 mg/ml |
40183ES |
適應(yīng)于2D和3D培養(yǎng)、侵襲和遷移實驗，也可以用于體內(nèi)成瘤實驗 |
|
|
40184ES |
主要應(yīng)用于需要顏色檢測如熒光檢測實驗等 |
||
|
高濃度 ≥18mg/ml |
40187ES |
主要應(yīng)用于如血管生成、凝膠栓塞和體內(nèi)成瘤實驗（對于血管生成建議基質(zhì)膠終濃度要≥10mg/ml） |
|
|
40189ES |
|||
|
40188ES |
Ceturegel® Matrix High Concentration，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠 |
||
|
低生長因子 |
40185ES |
主要是排除生長因子對實驗的干擾。應(yīng)用于與生長因子、信號通路等相關(guān)研究。無酚紅的也用來做類器官培養(yǎng) |
|
|
40186ES |
|||
|
干細(xì)胞用 |
40190ES |
主要用于如hESC，iPSC等干細(xì)胞培養(yǎng) |
|
|
類器官用 |
40191ES |
Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠 |
類器官培養(yǎng)專用基質(zhì)膠 |
|
鼠尾膠原 |
40125ES |
侵襲和遷移。培養(yǎng)或分化研究 |
|
|
40136ES |
侵襲和遷移。培養(yǎng)或分化研究 |
