Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)是兼容Illumina和MGI雙平臺(tái)的total RNA測序文庫構(gòu)建試劑盒，試劑盒包含RNA片段化試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)和鏈特異性ds-cDNA合成試劑，以及文庫擴(kuò)增試劑。可以銜接mRNA純化試劑盒或rRNA去除試劑盒構(gòu)建測序文庫。二鏈合成配有兩種模塊，客戶可根據(jù)需要進(jìn)行常規(guī)建庫或鏈特異性建庫。其中鏈特異性二鏈合成模塊中將dTTP替換為dUTP，使cDNA第二鏈中摻入dUTP，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴(kuò)增含尿嘧啶的DNA模板，實(shí)現(xiàn)鏈特異性。本試劑盒各模塊Buffer和Enzyme已提前預(yù)混，減少加樣步驟，使用更為便捷，所有試劑都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證，最大程度上保證了文庫構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

產(chǎn)品信息

貨號	12310ES08 / 12310ES24 / 12310ES96
規(guī)格	8 T / 24 T / 96 T

組分信息

組分編號		組分名稱	12310ES08	12310ES24	12310ES96
12310-A		Frag/Prime Buffer	150 μL	450 μL	2×900 μL
12310-B		1st Reaction Module	64 μL	192 μL	768 μL
12310-C		2nd Reaction Module 1(dNTP)	280 μL	840 μL	2×1680 μL
12310-D		2nd Reaction Module 2(dUTP)	280 μL	840 μL	2×1680 μL
12310-E		Ligation Reaction Module	280 μL	840 μL	2×1680 μL
12310-F		2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	200 μL	600 μL	2×1200 μL
12310-*	*	Primer Mix*	-	-	-
注：*標(biāo)注表示該成分不包含在本試劑盒，需要額外配置，本試劑盒組分兼容Illumina和MGI雙平臺(tái)，但需要額外配置專屬于Illumina®或者M(jìn)GI®的primer mix(Cat# 13334 Primer Mix for MGI®以及Cat# 13335 Primer Mix for Illumina®).

 

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用說明

實(shí)驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀：

一、關(guān)于接頭連接(Adapter Ligation)

1. 本公司可提供Illumina®或者M(jìn)GI®長接頭(Barcoded Adapter)試劑盒和短接頭試劑盒，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。

2. 我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭。如客戶使用自制接頭，請委托具有NGS引物合成經(jīng)驗(yàn)的公司，并備注需進(jìn)行嚴(yán)格的防污染控制。此外，進(jìn)行接頭退火操作時(shí)，請?jiān)诔瑑襞_(tái)完成。每次只操作一種接頭，防止交叉污染。

3. 使用接頭時(shí)，請?zhí)崆皩⒔宇^取出放在4°C或冰盒上解凍；在室溫操作時(shí)，實(shí)驗(yàn)室溫度最好不要超過25°C，防止接頭解鏈。

4. 建庫過程中，接頭濃度過高或過低都會(huì)導(dǎo)致建庫成功率變低。本試劑盒操作方案中，所加入的接頭體積固定為5 μL，請根據(jù)初始的RNA投入量，參考表1對接頭進(jìn)行稀釋。接頭稀釋液請選擇0.1×TE buffer，稀釋過的接頭可在4°C保存48小時(shí)。

表1-1  Input Total RNA量與Illumina®接頭使用濃度推薦表

Input Total RNA	Illumina® Adapter stock concentration
10 ng	1 μM
100 ng	1.5 μM
500 ng	3 μM
≥1 μg	5 μM

表1-2  Input Total RNA量與MGI®接頭使用濃度推薦表

Input Total RNA	MGI® Adapter stock concentration
100–499 ng	2 μM
500–4000 ng	5 μM

*可根據(jù)不同類型total RNA樣本及投入量，按需求適當(dāng)調(diào)整Adapter使用量

二、關(guān)于文庫擴(kuò)增 (Library Amplification)

1. 本試劑盒中的文庫擴(kuò)增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成，在第一代的基礎(chǔ)上，大大增強(qiáng)了擴(kuò)增的均一性，即使是低拷貝的基因，也能進(jìn)行無偏好性地?cái)U(kuò)增。

2. 文庫擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導(dǎo)致文庫偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒進(jìn)行文庫擴(kuò)增，Input Total RNA 量與相應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的推薦。

3. 表2中推薦的循環(huán)數(shù)可滿足絕大多數(shù)建庫需求，若您的樣本質(zhì)量較差（如降解嚴(yán)重的FFPE樣本），可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)。mRNA建庫時(shí)請?zhí)貏e注意，由于不同物種和組織所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差異較大，實(shí)驗(yàn)中需根據(jù)建庫起始量、物種類型及樣本處理情況適當(dāng)調(diào)整擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

表 2 Input Total RNA 量與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表*

Input Total RNA	Number of cycles
	Non-stranded	Stranded
10 ng	15	15
100 ng	14	14
500 ng	12	13
1 μg	11	12

【注】：*由于文庫產(chǎn)量不僅與投入量和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)相關(guān)，樣本質(zhì)量、片段化條件、分選條件等都會(huì)影響產(chǎn)量。建庫過程中請根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，選擇最合適的建庫條件。

三、DNA磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建庫過程中有多個(gè)步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進(jìn)行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

6. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個(gè)月。

四、關(guān)于文庫質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫濃度檢測：Qubit®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時(shí)，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

4. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop®等。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測。

五、自備材料 (Other Material)

1. mRNA富集試劑盒：Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat#12629)。

2. rRNA去除試劑盒：Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit(rRNA & ITS/ETS)（人/小鼠/大鼠rRNA去除，含ITS/ETS）(Yeasen Cat#12257)或其他rRNA去除試劑盒。

3. RNA純化磁珠： Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)或其他等效產(chǎn)品。

4. DNA純化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效產(chǎn)品。

5. RNA質(zhì)控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產(chǎn)品。

6.  Adapters：Complete Adapter for Illumina®使用（Cat#13519-13520或其他等效產(chǎn)品）或Complete Adapter for MGI®使用（Cat#13360-13362或其他等效產(chǎn)品）。

7. 文庫質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫定量試劑。

8. 其他材料：無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

六、建庫流程圖

圖1 RNA建庫流程圖