DNA甲基化修飾在維持正常細胞功能、基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、遺傳印記、胚胎發(fā)育、及腫瘤和疾病的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用。5mC可以導致基因沉默或基因表達水平降低，而5hmC則會導致基因激活或基因表達水平增高，研究表明腫瘤抑癌基因的過甲基化或原癌基因的低甲基化在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。因此，分析基因組的甲基化水平具有重要的臨床意義。

隨著分子檢測的不斷發(fā)展，甲基化qPCR檢測以及甲基化NGS檢測已成為非常普及的檢測技術(shù)，這兩種技術(shù)的必經(jīng)之路就是甲基化轉(zhuǎn)化，甲基化轉(zhuǎn)化從方法學上可分為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和酶法轉(zhuǎn)化，近幾年，基于DNA甲基化位點的檢測試劑盒陸續(xù)獲批面世。NMPA批準的甲基化檢測試劑盒大部分為熒光PCR法，主要原因在于熒光PCR法操作簡便，無需在PCR后電泳，且具有靈敏度高、特異性強、重復性好等特點。這些甲基化檢測試劑采用的轉(zhuǎn)化方法為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成為DNA甲基化檢測的“金標準”。但是傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化有很多局限性，例如過長的轉(zhuǎn)化時間、嚴重的DNA損傷、被高估的5mC水平、C-U轉(zhuǎn)化不完全等。

圖1.亞硫酸氫鹽催化C轉(zhuǎn)化為U的化學反應概要

2024年1月2日，芝加哥大學何川教授團隊在Nature Biotechnology上在線發(fā)表了題為Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5?methylcytosine in DNA and RNA的研究論文，該研究提出并開發(fā)了對DNA和RNA上的5-甲基胞嘧啶修飾進行快速，準確檢測的測序方法，簡稱為UBS-seq。該技術(shù)比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化反應過程加速20-30倍，同時明顯的降低了DNA損傷，以及C-U轉(zhuǎn)化不徹底導致的背景干擾。

圖2.UBS-seq法在微量樣本中應用，傳統(tǒng)BS轉(zhuǎn)化相比有更低的背景噪音

翌圣生物的Hieff^® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit便是基于此技術(shù)開發(fā)優(yōu)化而成，可以在98°C 5min條件下可完成＞99.5%的胞嘧啶轉(zhuǎn)化，并且極大的降低了DNA損傷，更好的保證了DNA片段的完整性。

圖3.Superfast DNA Methylation Bisulfite的技術(shù)原理及優(yōu)勢

Hieff^® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit（12225ES）將DNA變性與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化融合為一步，5分鐘內(nèi)即可完成轉(zhuǎn)化，約30 min可完成BS轉(zhuǎn)化全流程。采用柱內(nèi)脫硫技術(shù)，使操作流程更為簡單；可以滿足100 pg-2 μg樣品的轉(zhuǎn)化；未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的轉(zhuǎn)化率≥99%；轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物適用于PCR擴增和DNA測序等下游應用。

圖4.Superfast BS轉(zhuǎn)化實驗流程

使用12225與競品A和競品B轉(zhuǎn)化試劑盒進行頭對頭對比，轉(zhuǎn)化樣本為200 ng和2 μg的FFPE DNA，F(xiàn)FPE DNA中參入1% λ DNA，轉(zhuǎn)化后的樣本采用甲基化單鏈DNA建庫（12221ES），如圖5所示：12225對不同投入量的FFPE DNA中 λ DNA C的轉(zhuǎn)化率＞99.5%。

使用12225與競品B和競品C轉(zhuǎn)化試劑盒進行頭對頭對比，300 ng樣本為不含甲基化 λ DNA，800ng樣本為人基因組DNA，轉(zhuǎn)化后采用Qubit ssDNA定量，洗脫體積均為30 μL，轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物采用甲基化轉(zhuǎn)化特異性引物探針PCR，片段大小為286bp，擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，如圖6所示：12225的樣本回收率優(yōu)于競品B和競品C，且轉(zhuǎn)化后的甲基化特異性引物擴增效果最優(yōu)。

圖6.12225和競品的回收率

使用12225和競品A轉(zhuǎn)化試劑盒分別對gDNA樣本進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后使用甲基化單鏈建庫試劑盒（12221ES）建庫，文庫產(chǎn)量和質(zhì)控數(shù)據(jù)如圖6所示：12225和競品A轉(zhuǎn)化后相同的文庫pooling測序，12225下機數(shù)據(jù)量更多，ontarget_ratio(%)更高，Dup(%)更低。