1）引物設(shè)計錯誤。

1）設(shè)計原則：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位點(diǎn)(根據(jù)實驗需求保留或刪除)+基因特異性引物。

2）判斷方法：可用翌圣無縫克隆引物設(shè)計軟件核對

2）載體與目的片段使用比例失調(diào)。

1）載體和目的片段濃度測定方法：常用吸光度法或瓊脂糖電泳法。

2）載體與目的片段添加比例：

①單片段建議：最適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3，載體使用量為0.03 pmol；目的片段使用量為0.06-0.09 pmol。

②多片段建議：最適DNA使用量為每片段（含線性化載體）0.03 pmol。

3）載體與目的片段不純。

1）推薦對線性化載體、PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。

2）純化產(chǎn)物建議溶解在pH8.0的ddH2O中保存。

3）若為未純化的DNA，加入總體積不超過反應(yīng)體系體積1/5。

4）操作問題或試劑盒失效。

建議做試劑盒附帶的陽性對照實驗。判斷方法：

1）若陽性對照有克隆并檢測為陽性，則排除試劑盒問題。

2）若陽性對照無克隆，可能是操作問題或試劑盒失效，建議換其他人或換試劑盒進(jìn)行陽性對照實驗，進(jìn)一步確定問題。

1）感受態(tài)細(xì)胞效率低，＜10⁷ cfu/μg。

建議用轉(zhuǎn)化效率大于10⁷ cfu/μg的感受態(tài)細(xì)胞。

判斷方法：可轉(zhuǎn)化0.1ng質(zhì)粒（如PUC19），觀察克隆數(shù)，若生長大于1000個菌斑，則轉(zhuǎn)化效率大于10⁷ cfu/μg。

2）抗生素種類錯誤。

建議將未線性化載體轉(zhuǎn)化涂板。

判斷方法：若未長克隆，則可能是抗性種類錯誤或濃度過高。需檢查質(zhì)粒圖譜確認(rèn)抗性或確認(rèn)最適濃度。

1）載體線性化不完全。

建議將已制備的線性化的載體轉(zhuǎn)化涂板。  

判斷方法：如果長克隆較多，則表示線性化不完全。建議優(yōu)化酶切體系。

2）體系中混入了相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒。

1）產(chǎn)生原因：

①以反向PCR方式進(jìn)行載體線性化，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板導(dǎo)致。

②目的基因PCR模板為與載體相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒，殘留環(huán)狀 質(zhì)粒模板導(dǎo)致。

2）判斷方法：將已制備的線性化載體和目的片段分別轉(zhuǎn)化涂板，如果長克隆較多，則表示有相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒混入。建議PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用DpnI 消化模板后，再進(jìn)行膠回收純化處理或直接進(jìn)行膠回收純化處理，去除殘留的環(huán)狀模板質(zhì)粒導(dǎo)致的假陽性。

1）PCR產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。

1）可能情況：PCR擴(kuò)增目的基因時有非特異條帶出現(xiàn)，未進(jìn)行膠回收純化。

2）解決方案：

①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；

②膠回收PCR產(chǎn)物；

③鑒定更多的克隆。

2）片段缺失。

1）可能情況：載體或片段有多個同源重復(fù)序列。

2）解決方案：借助網(wǎng)站或軟件進(jìn)行序列比對（如NCBI， Vector NTI等）。