IF>1000經(jīng)典爆款！單片段連接Hieff Clone? Plus One Step Cloning Kit
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新升級(jí)產(chǎn)品10923ES重磅來(lái)襲！
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Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit是一款簡(jiǎn)便、快速、高效的DNA定向克隆產(chǎn)品，該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點(diǎn)，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的完全一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃反應(yīng)20 min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆?？寺￡?yáng)性率可達(dá)95%以上。
產(chǎn)品組分
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組分編號(hào) |
組分名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
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10911ES20 (20 T) |
10911ES50(50 T) |
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10911-A |
2×Hieff Clone® Enzyme Premix |
200 μL |
500 μL |
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10911-B |
500 bp Control Insert (25 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
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10911-C |
pUC 19 Control Vector, linearized (50 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
產(chǎn)品應(yīng)用
快速克隆；定向克隆；定點(diǎn)突變。
運(yùn)輸與保存方式
冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期1年。
注意事項(xiàng)
1. 需自備的材料：
1）自備樣品：自備好線性化載體和插入片段。
2）自備試劑（僅羅列部分）：
① 超級(jí)感受態(tài)：轉(zhuǎn)化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞（Cat#11802）；
② 高保真酶： 2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix（Cat#10149）或其他等效產(chǎn)品；
③ 菌落PCR mix：2×Hieff® Robust PCR Master Mix（With Dye)（Cat#10106）或其他等效產(chǎn)品；
④ 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000 × in Water)（Cat#10202）或其他等效產(chǎn)品；
3）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽，切膠儀，EP管等；
2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
3. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
實(shí)驗(yàn)流程
圖1 Hieff Clone® 一步法快速克隆試劑盒實(shí)驗(yàn)流程圖。
簡(jiǎn)版操作步驟
一、重組反應(yīng)
1. 線性化載體與插入片段使用量計(jì)算
Hieff Clone® 重組反應(yīng)體系最適載體使用量為0.03 pmol；最適載體與插入片段摩爾比為1:2-1:3，即最適插入片段使用量為0.06-0.09 pmol。這些摩爾數(shù)對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計(jì)算獲得：
最適載體使用量 = [0.02×載體堿基對(duì)數(shù)]ng (0.03 pmol)
最適插入片段使用量 = [0.04×插入片段堿基對(duì)數(shù)]ng (0.06 pmol) 或= [0.06×插入片段堿基對(duì)數(shù)]ng (0.09 pmol)
例如，將長(zhǎng)度為2 kb的插入片段克隆至長(zhǎng)度為5 kb的載體時(shí)，載體的最適使用量應(yīng)為：0.02 × 5000 = 100 ng；插入片段最適使用量應(yīng)為：0.04 × 2000 = 80 ng或0.06 × 2000=120 ng。
【注】：
- 當(dāng)插入片段長(zhǎng)度大于載體時(shí)，最適載體與插入片段使用量的計(jì)算方式應(yīng)互換，即插入片段當(dāng)做載體，載體當(dāng)做插入片段進(jìn)行計(jì)算。
- 線性化載體的使用量應(yīng)在50-200 ng之間；插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量應(yīng)在20-200 ng之間。當(dāng)使用上述公式計(jì)算最適使用量超出這個(gè)范圍時(shí)，則選擇最低或最高使用量即可。
- 線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過(guò)反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過(guò)4 μL。
2.重組反應(yīng)體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）
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組分 |
重組反應(yīng) |
陰性對(duì)照-1 |
陰性對(duì)照-2 |
陽(yáng)性對(duì)照 |
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ddH2O |
Up to 20 μL |
Up to 20 μL |
Up to 20 μL |
Up to 20 μL |
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2×Hieff Clone® Enzyme Premix |
10 μL |
0 μL |
0 μL |
10 μL |
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線性化載體 |
X μL |
X μL |
0 μL |
1 μL |
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插入片段 |
Y μL |
0 μL |
Y μL |
1 μL |
3.重組反應(yīng)條件
1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
2）置于50℃反應(yīng)20 min。當(dāng)插入片段＞5 kb時(shí)，可將孵育溫度延長(zhǎng)至25 min。
【注】：建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進(jìn)行反應(yīng)。
3）待反應(yīng)完成后，建議將反應(yīng)管置于冰上冷卻5 min，以防溫度過(guò)高降低感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。
4）反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可儲(chǔ)存于-20℃，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化。
二、 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板
1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802）。
2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置25 min。
3）42℃熱激45 sec，冰浴孵育1-2 min。
4）加入750 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育2 min充分復(fù)蘇。37℃，200 rpm，搖菌60 min。
5）5000 rpm離心1 min，棄掉750 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無(wú)菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
三、克隆鑒定
最方便快捷的方法是菌落PCR。用無(wú)菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至20-50 μL LB培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μL作為PCR模板。推薦至少用一條通用測(cè)序引物進(jìn)行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽(yáng)性的產(chǎn)生。后續(xù)也可做酶切或測(cè)序鑒定。
應(yīng)用實(shí)例
圖2：Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit可以有效克隆不同長(zhǎng)度的單片段基因。
A-D：重組轉(zhuǎn)化平板。E：插入片段和載體濃度檢測(cè)電泳圖。F-H：插入片段PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。
載體：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分別是1.2 kb，3 kb和5 kb，載體與插入片段摩爾比：1:3，重組反應(yīng)條件：50℃，20 min。
常見(jiàn)問(wèn)答
1、最佳克隆位點(diǎn)選擇？
答：在選擇克隆位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)避免選擇克隆位點(diǎn)上下游50 bp內(nèi)有重復(fù)序列的區(qū)域。當(dāng)克隆位點(diǎn)上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)時(shí)，重組效率將達(dá)到最大。若高于70%或者低于30%，重組效率會(huì)受到較大影響。
2、無(wú)克隆長(zhǎng)出或克隆數(shù)較少？
答：出現(xiàn)該情況，建議使用陽(yáng)性對(duì)照，可排除試劑盒本身的影響，并進(jìn)行進(jìn)一步判定，主要有以下可能情況：
1）引物設(shè)計(jì)不合適：推薦【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位點(diǎn)+基因特異性擴(kuò)增引物】，GC含量40% - 60%。
2）感受態(tài)細(xì)胞效率低：使用新鮮制備或妥善凍存的感受態(tài)細(xì)胞，確保其轉(zhuǎn)化效率>107 cfu/μg。每次操作時(shí)可設(shè)置一組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。連接產(chǎn)物體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
3）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量不足/過(guò)量，或者比例不佳：盡量按照推薦的量和比例配制重組反應(yīng)體系。
4）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物不純，抑制反應(yīng)：線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過(guò)反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過(guò)4 μL。建議線性化載體、插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化，純化產(chǎn)物溶解在ddH2O中。
3、出現(xiàn)較多假陽(yáng)性
答：主要有以下可能情況：
1）載體線性化不完全：即使是痕量未完全酶切的載體也會(huì)產(chǎn)生很高的轉(zhuǎn)化背景?？赏ㄟ^(guò)陰性對(duì)照檢測(cè)載體是否線性化完全，優(yōu)化酶切體系，提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長(zhǎng)酶切反應(yīng)時(shí)間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等都可以有效減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。
2）插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物：建議：①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；②膠回收PCR產(chǎn)物；③鑒定更多克隆。
3）反應(yīng)體系中混入了相同抗性的質(zhì)粒：PCR擴(kuò)增模板(載體或插入片段)為環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，若擴(kuò)增產(chǎn)物直接用于重組反應(yīng)，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板會(huì)產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)化背景。建議使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板、擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DpnI消化或擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。
4、菌落PCR無(wú)條帶
答：主要有以下可能情況：
1）引物不正確：推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。
2）PCR體系或程序不合適：沒(méi)有目的條帶也沒(méi)有空質(zhì)粒條帶，建議優(yōu)化PCR體系、程序；或者提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗(yàn)證；或者進(jìn)行酶切驗(yàn)證。
3）重組失敗：沒(méi)有目的條帶，只有空質(zhì)粒的條帶，說(shuō)明重組不成功，載體線性化不完全，建議優(yōu)化酶切體系。
HB230128
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