活體成像已經(jīng)成為生命科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷強(qiáng)有力的手段，通過對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行跟蹤記錄，有助于更方便有效地認(rèn)識(shí)人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和研究防治措施。該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、藥物研究、基因治療、細(xì)胞凋亡及流行病學(xué)等領(lǐng)域。

 

 

 

 

 

活體成像技術(shù)原理

 

圖1. 活體成像的發(fā)光原理
 

用熒光素酶（Luciferase）對(duì)基因、細(xì)胞和活體動(dòng)物進(jìn)行標(biāo)記，熒光酶基因表達(dá)的熒光素酶蛋白與底物熒光素在氧、Mg²⁺、ATP存在的條件下發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能釋放，在體外利用敏感的CCD設(shè)備形成圖像。向模式小鼠注射一次熒光素能保持其體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光持續(xù)30-45分鐘。
 

 

 

 

 

D-熒光素（D-Luciferin）

 

D-熒光素是熒光素酶的常用底物，普遍應(yīng)用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是體內(nèi)活體成像技術(shù)。D-熒光素有鉀鹽、鈉鹽和自由酸3種形式，其中鉀鹽和鈉鹽以其良好的水溶解性和極低的反應(yīng)毒性廣泛應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中。

表1.三種D-熒光素的性質(zhì)

產(chǎn)品性質(zhì)	D-熒光素鈉鹽(40901)	D-熒光素鉀鹽(40902)	D-熒光素，游離酸(40903)
分子式	NaC11H7N2O3S2   · H2O	C11H7N2O3S2   K	C11H8N2O3S2
分子量	320.32 g/mol	318.42 g/mol	280.33 g/mol
外觀	淡黃色粉末	淡黃色粉末	類白色至淺黃色粉末
溶解性	易溶于水 （100 mg/ml）	易溶于水 （60 mg/ml）	難溶于水，可加稀堿促進(jìn)溶解
應(yīng)用范圍	體外（In   vitro）：體外化學(xué)發(fā)光；報(bào)告基因分析，免疫分析；高靈敏度ATP分析 體內(nèi)（In vivo）：活細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)Luc標(biāo)記基因和熒光素酶-融合基因表達(dá)的成像分析

 

 

 

 

 

Yeasen D-熒光素在腫瘤研究中的應(yīng)用

 

 

1

抗腫瘤藥物活體水平藥效學(xué)評(píng)價(jià)-溶瘤病毒（Cat. NO 40902）

新城疫病毒（NDV）由于其天然的溶瘤特性已被應(yīng)用于溶瘤病毒治療數(shù)十年。而α2,6-連接的唾液酸對(duì)于NDV結(jié)合和腫瘤細(xì)胞感染至關(guān)重要。

Li, Q等^【1】在2017年發(fā)表的文章中，用熒光素酶標(biāo)記NDV后，活體成像實(shí)驗(yàn)表明，NDV對(duì)細(xì)胞表面α2,6-唾液酸高表達(dá)的侵襲性SW620大腸癌細(xì)胞具有強(qiáng)力的抗腫瘤作用，而對(duì)表達(dá)一般水平α2,6-唾液酸的SW480細(xì)胞抗腫瘤作用不明顯。

圖2. 分別用SW620和 SW480皮下種瘤后用PBS和rNDV-Luci處理，rNDV-Luci在小鼠腫瘤部位具有強(qiáng)熒光信號(hào)

 

2

 探究基因沉默抑制腫瘤生長的機(jī)制（Cat. NO 40903）

有研究發(fā)現(xiàn)，COPB2在胃癌細(xì)胞系中大量過表達(dá)。An, C等^【2】通過敲除COPB2，抑制RTK信號(hào)及其下游信號(hào)級(jí)聯(lián)分子促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，并降低裸鼠的腫瘤生長。活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Lv-shCOPB2感染組小鼠體內(nèi)總熒光強(qiáng)度較Lv-shRNA對(duì)照感染組小鼠明顯降低。

圖3. Lv-shCOPB2感染組小鼠體內(nèi)總熒光強(qiáng)度較Lv-shRNA對(duì)照感染組小鼠明顯降低
 

3

 尋找新的癌癥治療靶點(diǎn)（Cat. NO 40901）

復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院團(tuán)隊(duì)在2017年發(fā)表的一篇文章^【3】中表明，TIPE2的過表達(dá)能顯著抑制4T1細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖。TIPE2增加了T細(xì)胞和NK細(xì)胞，減少了MDSCs。TIPE2可上調(diào)腫瘤微環(huán)境中的CD8+ T和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，并增強(qiáng)細(xì)胞毒性。TIPE2 抑制乳腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移可能是通過促進(jìn)CD8+ T和NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，TIPE2可能是乳腺癌的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

圖4. 用正常4T1細(xì)胞TIPE2過表達(dá)4T1細(xì)胞分別皮下種瘤，TIPE2組小鼠腫瘤明顯更小，且未發(fā)生轉(zhuǎn)移

 

 

 

 

 

參考文獻(xiàn)

 

 

4

 CAR-T療法在實(shí)體瘤中的療效研究（Cat. NO 40901）

嵌合抗原受體-T（CAR-T）細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的治療效果不佳，主要原因是其到達(dá)和侵入腫瘤病灶的能力有限。實(shí)體瘤的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、特異性抗原的喪失、強(qiáng)烈的免疫抑制環(huán)境是CAR-T療法治療實(shí)體瘤的挑戰(zhàn)。 

針對(duì)于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）患者，有作者將MUC1作為研究目標(biāo)^【4】，分別構(gòu)建第二代CAR和同時(shí)分泌IL-22的第四代CAR。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)CAR-MUC1-IL-22 T細(xì)胞相對(duì)于MUC1 + HNSCC細(xì)胞具有更強(qiáng)、更有效的細(xì)胞毒功能。表明CAR-T在治療HNSCC患者中的潛在有效性，為MUC1+CAR-T治療提供了證據(jù)基礎(chǔ)。

圖5. 用不同的CAR-T處理HNSCC模型小鼠，結(jié)果顯示第四代CAR比第二代CAR療效更佳

近期，來自中國科學(xué)院動(dòng)物研究所和北京協(xié)和醫(yī)院的博士團(tuán)隊(duì)通過對(duì)基因表達(dá)譜互動(dòng)分析發(fā)現(xiàn)，C-C基團(tuán)趨化因子配體（CCL）20在肺癌和其他發(fā)病率和/或死亡率最高的癌癥如結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌和肝癌中高表達(dá)^【5】。C-C基團(tuán)趨化因子受體6（CCR6）的強(qiáng)制表達(dá)，導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞向分泌CCL20的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

在肺癌異種移植小鼠模型中，CCR6過表達(dá)的CAR-T細(xì)胞在輸注后有效地遷移并浸潤到實(shí)體瘤中，從而有效地清除腫瘤，并顯著延長了帶瘤小鼠的生存期。該研究結(jié)果為實(shí)體瘤免疫療法中趨化因子受體工程化的CAR-T細(xì)胞的臨床開發(fā)提供了支持證據(jù)。

圖6. 在CAR-T細(xì)胞中過表達(dá)CCR6可顯著增強(qiáng)其向?qū)嶓w瘤的遷移和浸潤，延長小鼠生存期

 

 

 

 

 

參考文獻(xiàn)

 

【1】Li, Q., Wei, D., Feng, F. et al. α2,6-linked sialic acid serves as a high-affinity receptor for cancer oncolytic virotherapy with Newcastle disease virus. J Cancer Res Clin Oncol 143, 2171–2181 (2017).

【2】An, C., Li, H., Zhang, X., Wang, J., Qiang, Y., Ye, X., Li, Q., Guan, Q., Zhou, Y."Silencing of COPB2 inhibits the proliferation of gastric cancer cells and induces apoptosis via suppression of the RTK signaling pathway". International Journal of Oncology 54.4 (2019): 1195-1208.

【3】 Zhenhua Zhang, Li Liu, Shousong Cao, Yizhun Zhu, Qibing Mei, Gene delivery of TIPE2 inhibits breast cancer development and metastasis via CD8+ T and NK cell-mediated antitumor responses, Molecular Immunology, Volume 85, 2017, Pages 230-237, ISSN 0161-5890

【4】Mei, Z, Zhang, K, Lam, AK‐Y, et al. MUC1 as a target for CAR‐T therapy in head and neck squamous cell carinoma. Cancer Med. 2020; 9: 640– 652.

【5】Liyuan Jin, Lei Cao, Yingjie Zhu, Jiani Cao, Xiaoyan Li, Jianxia Zhou, Bing Liu, Tongbiao Zhao, Enhance anti-lung tumor efficacy of chimeric antigen receptor-T cells by ectopic expression of C–C motif chemokine receptor 6, Science Bulletin,2020.

 

 

 

 

 

常見問題FAQ

 

 

Q: 底物的激發(fā)波長和發(fā)射長？

A: 化學(xué)發(fā)光，無需激發(fā)波長。螢火蟲熒光素發(fā)射波長是 560nm。

Q: 熒光素類注射方式和用量？

A: 一般采用腹腔注射或尾靜脈注射法，科學(xué)的方法是根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線評(píng)估注射劑量。建議最初嘗試注射劑量為：150mg底物/kg小鼠體重。

Q: 腹腔注射和尾靜脈注射方式的區(qū)別是什么？

A: 熒光素可通過腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內(nèi)。腹腔注射擴(kuò)散較慢，開始發(fā)光較慢，持續(xù)發(fā)光時(shí)間較長。尾部靜脈注射形式擴(kuò)散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間較短。

Q: 推薦使用什么儀器？可以用多功能酶標(biāo)儀嗎？

A: 推薦使用具有生物化學(xué)發(fā)光檢測模塊的儀器，熒光素產(chǎn)生的光可以被光度計(jì)或閃爍計(jì)數(shù)器檢測。常見的活體成像儀器如IVIS^® Lumina小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，德國Bruker公司的In-Vivo Xtreme多模式小動(dòng)物活體成像儀等。如果使用多功能酶標(biāo)儀，需要和儀器廠家確認(rèn)是否具有生物化學(xué)發(fā)光檢測模塊。

Q: 底物可以進(jìn)入活細(xì)胞中或者血腦屏障嗎？

A：D-熒光素約280道爾頓，熒光素的水溶性和脂溶性都非常好，可以通過血腦屏障、胎盤屏障和血液測試屏障，也可以進(jìn)入活細(xì)胞。
 

使用Yeasen 活體成像試劑已發(fā)表的高分文章（部分）

1、 Hao M , Hou S , Li W , et al. Combination of metabolic intervention and T cell therapy enhances solid tumor immunotherapy[J]. Science Translational Medicine, 2020, 12(571):eaaz6667. （IF: 16.304）

2、Guang Chen, Xiao-yan Fan, Xiao-peng Zheng et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells ameliorate insulin resistance via PTEN-mediated crosstalk between the PI3K/Akt and Erk/MAPKs signaling pathways in the skeletal muscles of db/db mice, 24 February 2020（IF: 6.691）

3、Zhou Y, Zhou C, Zou Y, et al. Multi pH-sensitive polymer-drug conjugate mixed micelles for efficient co-delivery of doxorubicin and curcumin to synergistically suppress tumor metastasis [published online ahead of print, 2020 Aug 19]. Biomater Sci. 2020;10.1039/d0bm00840k. （IF: 6.183）

4、 Qiu J , Peng P , Xin M , et al. ZBTB20-mediated titanium particle-induced peri-implant osteolysis by promoting macrophage inflammatory responses. Biomater Sci. 2020;8(11):3147-3163. （IF: 6.183）

5、Tang Y, Lin S, Yin S, et al. In situ gas foaming based on magnesium particle degradation: A novel approach to fabricate injectable macroporous hydrogels. Biomaterials. 2020;232:119727. (IF 5.31) 

 

 

 

 

 

產(chǎn)品訂購

 

 

名稱	貨號(hào)	規(guī)格
D-Luciferin, Sodium Salt D-熒光素鈉鹽	40901ES01/02/03/08	100mg/500mg/1g/5g
D-Luciferin, Potassium Salt D-熒光素鉀鹽	40902ES01/02/03/08	100mg/500mg/1g/5g
D-Luciferin Firefly, Free Acid  D-螢火蟲熒光素，游離酸	40903ES01/02/03/08	100mg/500mg/1g/5g

 

 

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