活體成像生物發(fā)光技術(shù)——直觀靈敏的體內(nèi)追蹤成像技術(shù)
活體成像技術(shù)是指應(yīng)用影像學方法，在不損傷動物的前提下，對活體狀態(tài)下的生物過程進行組織、細胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)。通過這項技術(shù)可以非侵入式、直觀地觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長，轉(zhuǎn)移、疾病的發(fā)展過程、基因的表達變化等生物學過程。與傳統(tǒng)剝瘤稱重測量的方法相比，活體成像能夠?qū)ν环N實驗對象在不同時間點進行觀察，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因），數(shù)據(jù)更加真實可信，成本更低，靈敏度更高。目前活體成像技術(shù)主要采用生物發(fā)光（Bioluminescence）與熒光（Fluorescence）兩種技術(shù)，生物發(fā)光技術(shù)是用熒光素酶（Luciferase）基因標記細胞或者DNA，而熒光技術(shù)則是應(yīng)用熒光蛋白（如GFP, Mcherry等）標記細胞或是蛋白等研究對象。其中生物發(fā)光技術(shù)因其操作簡單，反應(yīng)靈敏，在腫瘤，分子互作及信號傳導(dǎo)等研究中得到了廣泛應(yīng)用。
技術(shù)原理
活體成像生物發(fā)光技術(shù)是指在小的哺乳動物體內(nèi)利用報告基因（如熒光素酶基因）表達產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學能轉(zhuǎn)化為可見光能釋放，然后在體外利用敏感的CCD設(shè)備形成圖像。發(fā)光強度與標記細胞的數(shù)目呈線性相關(guān)。熒光素酶報告基因質(zhì)?？梢员徊迦攵喾N基因的啟動子，成為某種基因的報告基因，通過檢測報告基因從而實現(xiàn)對目標基因的監(jiān)測。
圖1：熒光素酶催化熒光素發(fā)光反應(yīng)
生物發(fā)光其本質(zhì)為化學發(fā)光，熒光素被熒光素酶氧化的過程中可以釋放波長廣泛的可見光，波長范圍為460-630nm（平均波長為560nm）。在哺乳動物體內(nèi)，血紅蛋白是吸收可見光的主要成分，能吸收藍綠光波段中的大部分可見光；水和脂質(zhì)主要吸收紅外線，但其均對波長為590-800nm的紅光近紅外線吸收能力較差，因此波長超過600nm的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳組織被高靈敏的CCD檢測到。
圖2：活體成像檢測原理，儀器及實驗效果圖
產(chǎn)品簡介
翌圣為科研工作者提供三種形式的熒光素底物
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D-Luciferin, Sodium Salt（熒光素鈉鹽） |
D-Luciferin, Potassium Salt（熒光素鉀鹽） |
D-Luciferin Firefly, Free Acid（熒光素游離酸） |
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分子式 |
NaC11H7N2O3S2·H2O |
C11H7N2O3S2 K |
C11H8N2O3S2 |
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分子量 |
320.32 |
318.42 |
280.33 |
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外觀 |
淡黃色粉末 |
淡黃色粉末 |
類白色至淺黃色粉末 |
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溶解性 |
易溶于水（100 mg/ml） |
易溶于水（60 mg/ml） |
難溶于水，可加入稀堿促進其溶解。 |
產(chǎn)品應(yīng)用
活體成像技術(shù)應(yīng)用范圍主要包括：癌癥與抗癌藥物研究、免疫學與干細胞的研究、細胞凋亡、病理機制及病毒研究、基因表達和蛋白質(zhì)之間相互作用、轉(zhuǎn)基因動物模型構(gòu)建、藥效評估、藥物甄選與預(yù)臨床檢驗、藥物配方與劑量管理、腫瘤學應(yīng)用、生物光子學檢測、視頻監(jiān)督與環(huán)境監(jiān)督等。
1．腫瘤學
活體成像技術(shù)可以在近無創(chuàng)條件下對活體組織或小動物體內(nèi)的生物學行為進行成像跟蹤，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中。
活體生物發(fā)光成像技術(shù)能夠讓研究人員直接快速的測量各種癌癥模型中腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及對藥物的反應(yīng)。其特點是極高的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個細胞）也可以被檢測的到。比傳統(tǒng)方法的檢測靈敏度大大提高，非常適合于腫瘤體內(nèi)生長的定量分析。避免屠殺老鼠而造成的組間差異，節(jié)省動物成本。由于以上特點，使基于轉(zhuǎn)移模型、原位模型、自發(fā)腫瘤模型等方面的腫瘤學研究得到發(fā)展。建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型，可以觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，進一步探討腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。
圖3： 活體成像檢測EPS8L3對小鼠肺部HCCLM3細胞成瘤的影響[1]
2.藥物研究
（1）抗腫瘤藥物研究
由于活體成像技術(shù)具有更高的靈敏度，比傳統(tǒng)方法能夠更精準地對早期瘤塊細胞進行檢測。同時，該技術(shù)檢測到的細胞僅為活細胞。因此，該技術(shù)能夠更早更靈敏地發(fā)現(xiàn)藥物的療效。
通過給予腫瘤接種的小鼠不同劑量、不同給藥時間、不同給藥途徑，觀察并制定合適的劑型與服藥時間。
圖4：活體成像檢測CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 T細胞對小鼠皮下注射HN4細胞成瘤的治療作用[2]
（2）藥物代謝相關(guān)研究：
標記與藥物代謝有關(guān)的基因，研究不同藥物對該基因表達的影響，從而間接獲知相關(guān)藥物在體內(nèi)代謝的情況。在藥劑學研究方面，可通過把熒光素酶報告基因質(zhì)粒直接裝在載體中，觀察藥物載體的靶向臟器與體內(nèi)分布規(guī)律。在藥理學方面，可用熒光素酶基因標記目的基因，觀察藥物作用的通路。
（3）細胞標記
免疫細胞研究：標記免疫細胞，觀察免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺死功能，評價免疫細胞的免疫特異性、增殖、遷移等功能。
干細胞研究：A：標記組成性表達的基因，在轉(zhuǎn)基因動物水平，標記干細胞，若將干細胞移植到另外動物體內(nèi)，可用活體生物發(fā)光成像技術(shù)示蹤干細胞在體內(nèi)的增殖、分化及遷移的過程。B：用慢病毒直接標記細胞后，移植到體內(nèi)觀測其增殖、分化及遷移過程，研究其修復(fù)、治療損傷或缺陷部分的效果，進一步探討其機制。
圖5：小鼠骨骼肌注射HUC-MSCs細胞后利用活體成像檢測細胞的定位[3]
（4）基因表達與基因功能的研究
將熒光素酶基因插入到目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。該方式可實現(xiàn)目的基因與熒光素酶的表達平行，從而可直接觀察目的基因的表達模式，包括數(shù)量、時間、部位及影響其表達和功能的因素。
（5）細胞凋亡
用分子生物學方法在熒光酶的兩端連接上抑制發(fā)光的蛋白（如激素酶），但在其連接處加上caspase，細胞發(fā)生凋亡時，表達caspase，切開抑制熒光酶發(fā)光的蛋白，使熒光素酶開始發(fā)光。
應(yīng)用前景
活體成像技術(shù)能夠?qū)⒎肿由飳W技術(shù)從體外研究轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)研究。因此，該技術(shù)能夠觀測活體動物內(nèi)的基因表達和細胞活動，并且該技術(shù)具有檢測靈敏度高，操作簡單等優(yōu)勢，正在越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學及生物學研究領(lǐng)域。
客戶已發(fā)表文章
1. Chen G, Fan XY, Zheng XP, Jin YL, Liu Y, Liu SC. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells ameliorate insulin resistance via PTEN-mediated crosstalk between the PI3K/Akt and Erk/MAPKs signaling pathways in the skeletal muscles of db/db mice. Stem Cell Res Ther. 2020 Sep 16;11(1):401. doi: 10.1186/s13287-020-01865-7. PMID: 32938466; PMCID: PMC7493876.
2. Tang Y, Lin S, Yin S, Jiang F, Zhou M, Yang G, Sun N, Zhang W, Jiang X. In situ gas foaming based on magnesium particle degradation: A novel approach to fabricate injectable macroporous hydrogels. Biomaterials. 2020 Feb;232:119727. doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.119727. Epub 2019 Dec 24. PMID: 31918223.
3. Xuan Z, Zhao L, Li Z, Song W, Chen J, Chen J, Chen H, Song G, Jin C, Zhou M, Xie H, Zheng S, Song P. EPS8L3 promotes hepatocellular carcinoma proliferation and metastasis by modulating EGFR dimerization and internalization. Am J Cancer Res. 2020 Jan 1;10(1):60-77. PMID: 32064153; PMCID: PMC7017737.
4. Zhou Y , Zhou C , Zou Y , Jin Y , Han S , Liu Q , Hu X , Wang L , Ma Y , Liu Y . Multi pH-sensitive polymer-drug conjugate mixed micelles for efficient co-delivery of doxorubicin and curcumin to synergistically suppress tumor metastasis. Biomater Sci. 2020 Sep 21;8(18):5029-5046. doi: 10.1039/d0bm00840k. Epub 2020 Aug 19. PMID: 32812957.
5. Qiu J , Peng P , Xin M , Wen Z , Chen Z , Lin S , Kuang M , Fu Y , Fang G , Li S , Li C , Mao J , Qin L , Ding Y . ZBTB20-mediated titanium particle-induced peri-implant osteolysis by promoting macrophage inflammatory responses. Biomater Sci. 2020 Jun 7;8(11):3147-3163. doi: 10.1039/d0bm00147c. Epub 2020 May 4. PMID: 32363359.
FAQ
Q1：生物發(fā)光與熒光技術(shù)的比較
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生物發(fā)光 |
熒光 |
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優(yōu)點 |
（1）高度靈敏 （2）成像速度快，圖像清楚 （3）在體內(nèi)可檢測到102個細胞 |
（1）有多種蛋白和染料可用 （2）可進行多重標記，標記相對簡單 （3）可同時用于FACS分類 |
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缺點 |
（1）信號較弱，需要靈敏的CCD鏡頭 （2）對儀器的精密度要求較高 （3）目標細胞或者基因需要標記 |
（1）非特異性熒光對其靈敏度產(chǎn)生限制 （2）體內(nèi)檢測最低約106細胞 （3）需要不同波長的激發(fā)光 （4）很難精確體內(nèi)定量 |
Q2：如何能檢測到體內(nèi)發(fā)出的可見光？
A：兩個主要的原因能夠保證可見光成像技術(shù)能夠檢測到體內(nèi)發(fā)出的微弱的可見光。a：高靈敏度的制冷CCD鏡頭，可達到零下-105℃，體內(nèi)發(fā)出的非常少的光子也能檢測得到。b：絕對密封的暗箱裝置，可以屏蔽包括射線在內(nèi)的所有光線。
Q3：大鼠可否用作活體成像實驗？
A：成體老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的區(qū)別只在于對可見光的穿透性不同，可見光的穿透能力在3-4cm之間，所以大鼠也可以作為活體成像的動物，關(guān)于大鼠活體成像已有很多文章發(fā)表。
Q4：CCD鏡頭的低溫會不會對小動物產(chǎn)生影響？
A：不會的，低溫的范圍只局限于CCD鏡頭的小范圍內(nèi)，其他范圍內(nèi)都是室溫。
Q5：用熒光素進行活體成像與綠色熒光蛋白檢測體內(nèi)發(fā)光相比優(yōu)勢何在？
A：熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強近100倍。熒光素是靠和熒光素酶的相互作用發(fā)光，特異性很強，得到的信噪比較高；熒光蛋白需要激發(fā)光來產(chǎn)生反射光，但是在檢測的過程中，老鼠的皮毛，皮膚都會產(chǎn)生非特異性熒光，使得信噪比降低。熒光蛋白檢測更適合于體外檢測，熒光素酶的檢測更適合于體內(nèi)檢測。
Q6：與傳統(tǒng)技術(shù)相比，生物發(fā)光成像技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在哪些方面？
A：與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該技術(shù)對于腫瘤轉(zhuǎn)移的研究、基因治療、流行病學的發(fā)病學研究，干細胞示蹤，白血病的相關(guān)研究等方面，用該技術(shù)進行腫瘤的藥效研究，比傳統(tǒng)方法更靈敏，還可以通過一系列轉(zhuǎn)基因動物疾病模型，來快速直觀的進行相關(guān)疾病的發(fā)病機理和藥物篩選研究。
Q7：如何用熒光素酶基因標記干細胞嗎？
A：可標記組成性表達的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，干細胞就被標記了，從該小鼠的骨髓取出造血干細胞，移植到另外一只小鼠的骨髓內(nèi)，可以用該技術(shù)示蹤造血干細胞在體內(nèi)的增殖和分化及遷徙到全身的過程。另外一種方法是用慢病毒標記神經(jīng)干細胞。
Q8：在注射熒光素后多久進行檢測比較合適，發(fā)光能持續(xù)多久？
A：腹腔注射一般10-15min后熒光信號達到最強的穩(wěn)定期，20-30min后開始衰減，3h后熒光素排除，發(fā)光完全消失。
Q9：怎么將熒光素注入小鼠體內(nèi)，注射方法之間的區(qū)別是什么？
A：熒光素可通過腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內(nèi)。約1 min可擴散到小鼠全身。大部分情況下使用熒光素濃度為150 mg/kg。對于20 g的小鼠約使用3 mg的熒光素即可。對于腹腔注射來講，擴散較慢，開始發(fā)光較慢，持續(xù)發(fā)光時間較長。對于熒光素的尾部靜脈注射，擴散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時間較短。
參考文獻
[1] Xuan Z, Zhao L, Li Z, Song W, Chen J, Chen J, Chen H, Song G, Jin C, Zhou M, Xie H, Zheng S, Song P. EPS8L3 promotes hepatocellular carcinoma proliferation and metastasis by modulating EGFR dimerization and internalization. Am J Cancer Res. 2020 Jan 1;10(1):60-77. PMID: 32064153; PMCID: PMC7017737.
[2] Mei Z, Zhang K, Lam AK, Huang J, Qiu F, Qiao B, Zhang Y. MUC1 as a target for CAR-T therapy in head and neck squamous cell carinoma. Cancer Med. 2020 Jan;9(2):640-652. doi: 10.1002/cam4.2733. Epub 2019 Dec 4. PMID: 31800160; PMCID: PMC6970025.
[3] Chen G, Fan XY, Zheng XP, Jin YL, Liu Y, Liu SC. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells ameliorate insulin resistance via PTEN-mediated crosstalk between the PI3K/Akt and Erk/MAPKs signaling pathways in the skeletal muscles of db/db mice. Stem Cell Res Ther. 2020 Sep 16;11(1):401. doi: 10.1186/s13287-020-01865-7. PMID: 32938466; PMCID: PMC7493876.
產(chǎn)品信息
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產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
價格（元） |
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40901ES01/02/03/08/10 |
0.1/0.5/1/5/10 g |
1008/2556/3996/15876/31212 |
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40902ES01/02/03/08 |
0.1/0.5/1/5 g |
1000/2600/3996/14898 |
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40903ES01/02/03 |
0.1/0.5/1 |
708/2556/3588 |
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40904ES02/03/08 |
0.5/1/5 mg |
589/1049/3899 |
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40905ES02/03 |
0.5/1 mg |
789/1499 |
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40906ES02/03/08 |
0.5/1/5 mg |
1329/2359/6759 |
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40907ES10 |
10 vials |
6856 |
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40908ES02/03 |
0.5/1 mg |
1329/2359 |
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40909ES72 |
250 μg |
2359.00 |
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40910ES72 |
250 μg |
2359.00 |
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40911ES72 |
250 μg |
2359.00 |
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40912ES02/03 |
0.5/1 mg |
1329/2359 |
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40913ES50 |
50 μg |
929 |
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11402ES60/80 |
100/1000次 |
536/4236 |
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11401ES60/76/80 |
100/500/1000次 |
349/969/1748 |
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HB210803
