雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)~實驗操作篇
自1990年螢光素酶生物傳感器技術(shù)誕生以來，單螢光素酶檢測系統(tǒng)到雙螢光素酶檢測系統(tǒng)的發(fā)展，為科研人員提供了更為嚴謹?shù)膶嶒炇侄巍ｋp螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在單報告基因的基礎(chǔ)上引入了“內(nèi)參對照”報告基因，可以排除不同組之間細胞生長狀況、細胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實驗結(jié)果更為可靠。今天小翌將從雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)的原理與應(yīng)用開篇，給大家分享雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)的實驗操作流程。
一
雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)原理
螢火蟲螢光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，大小為61KDa。在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化底物螢火蟲螢光素氧化，生成氧化螢光素，并發(fā)出黃綠色光，其最強發(fā)光波長為560nm。
二
雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)應(yīng)用
◆ microRNA研究
◆ 轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究
在報告基因的5'端加上待檢測基因的啟動子，就可以用來檢測轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用，啟動轉(zhuǎn)錄越多，那報告基因的表達量就越大，熒光值越高。
◆ 啟動子研究
將啟動子區(qū)域序列進行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c進行突變，再分別構(gòu)建到luciferase報告載體中，檢測其啟動子活性。
◆ 信號通路研究
信號通路的激活/監(jiān)測基因的表達水平。
......
三
雙螢光素酶報告基因檢測實驗操作流程
報告基因檢測流程主要有4個模塊：分別是質(zhì)粒構(gòu)建、細胞轉(zhuǎn)染、報告基因檢測和數(shù)據(jù)分析。
雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)一般將螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒和海腎螢光素酶報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，或?qū)⑦@兩個報告基因構(gòu)建到同一個骨架質(zhì)粒上（如pGL4質(zhì)粒），分別用不同的啟動子啟動其表達。
◆ 主報告基因載體的選擇
根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇對應(yīng)的載體骨架。
◆ 內(nèi)參報告基因載體的選擇
帶有表達組成型啟動子的螢光素酶表達載體作為內(nèi)參。
◆ 轉(zhuǎn)染細胞系選擇
◆ 轉(zhuǎn)染方法選擇
◆ 轉(zhuǎn)染報告基因比例
◆ 啟動子和轉(zhuǎn)錄因子比例
◆ 核酸與轉(zhuǎn)染試劑的比例
從1:2開始調(diào)整，另外，注意質(zhì)粒的純度、完整度和去內(nèi)毒素。
◆ 檢測試劑選擇
◆ 檢測板選擇
◆ 檢測儀器選擇
注：只選擇在最大波長處檢測發(fā)光，過濾掉其他發(fā)光信號，意味著檢測會丟掉很多信號，丟失靈敏度。
檢測時間：輝光型0.5-1 sec，閃光型2-10 sec。
通過儀器可以直接讀出螢火蟲和海腎螢光素酶的數(shù)值，兩種熒光值讀數(shù)不少于4位數(shù)，讀數(shù)大于8位數(shù)時，需要稀釋裂解上清（讀數(shù)與細胞種類、細胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染方法、轉(zhuǎn)染時間等因素相關(guān)）。
歸一化值=螢火蟲螢光素酶讀值（主報告基因）/海腎螢光素酶讀值（內(nèi)參基因）
相對表達倍數(shù)=實驗組歸一化值/對照組歸一化值
給大家舉個例子：
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分類 |
F-Luc |
R-Luc |
歸一化（F/R) |
平均值 |
相對表 達倍數(shù) |
|
對照組1 |
20118 |
50201 |
0.400748989 |
0.420043613 |
1 |
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對照組2 |
18919 |
48091 |
0.393400012 |
||
|
對照組3 |
21910 |
47019 |
0.465981837 |
||
|
實驗組1 |
60129 |
60911 |
0.987161596 |
1.226184349 |
2.919183 |
|
實驗組2 |
87927 |
56873 |
1.546023596 |
||
|
實驗組3 |
78791 |
68791 |
1.145367853 |
下期小翌將會結(jié)合大家的留言進一步分享~
相關(guān)產(chǎn)品
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類別 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號 |
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螢光素酶報告基因載體 |
11555ES03 |
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11556ES03 |
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|
11557ES03 |
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轉(zhuǎn)染試劑 |
40802ES02/03/08 |
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血清 |
40130ES25/76 |
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|
支原體檢測 |
40612ES25/60 |
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|
單/雙螢光素酶報告 基因檢測試劑 |
11401ES60/76/80 |
|
|
11402ES10/60/80 |
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|
11404ES10/60/80 |
||
|
11405ES10/60/80 |
