作為一名實(shí)驗(yàn)人員，載體構(gòu)建你一定不陌生，而T4 DNA連接酶負(fù)責(zé)將目的片段連接到載體上，正是決定實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵元素之一。那么T4 DNA連接酶在分子克隆實(shí)驗(yàn)中起到什么作用呢？又是怎么起作用的呢？除了載體構(gòu)建，T4 DNA連接酶還能在那些實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮作用呢？下面小翌就來帶你更全面的認(rèn)識T4 DNA 連接酶。

 

T4 DNA連接酶的簡介

基因工程中用到的連接酶主要是大腸桿菌DNA連接酶以及T4 DNA連接酶，目前后者的應(yīng)用更為廣泛。T4 DNA連接酶可以修補(bǔ)雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA/RNA雜合鏈上的單鏈切口，使兩個(gè)相鄰的核苷酸連接起來，在DNA修復(fù)和重組中起著重要的作用。

 

在傳統(tǒng)的酶切酶連法載體構(gòu)建過程中，T4 DNA連接酶可以搭配限制性內(nèi)切酶一起完成酶切酶連實(shí)驗(yàn)。它可以催化雙鏈DNA的5’-P末端和3’-OH末端之間形成磷酸二酯鍵，并且對黏性末端連接和平末端連接都有不錯的連接效率，適用性廣，使用者也比較多。

圖1. T4 DNA連接酶的作用原理

 

T4 DNA連接酶的連接策略

 

1

載體構(gòu)建

在載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)中，選擇不同的限制性內(nèi)切酶，可以產(chǎn)生不同類型的末端。針對不同的末端，T4 DNA連接酶會有不同的連接策略。

 

酶切酶連，單酶切產(chǎn)生的黏性末端

在載體構(gòu)建過程中，如果使用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因DNA片段和載體分子可以產(chǎn)生相同的黏性末端，T4 DNA連接酶可以將直接進(jìn)行重組連接。但是因?yàn)轲ば阅┒讼嗤康幕蛘蚧蛘叻聪蚨伎梢越尤胼d體，這樣容易增加篩選正確重組克隆的工作量，可以考慮使用雙酶切的方法進(jìn)行載體構(gòu)建。

此外，單酶切制備的載體，自身的黏性末端也可以進(jìn)行配對，進(jìn)而在T4 DNA連接酶的作用下在核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，發(fā)生載體自連。使用堿性磷酸酶處理酶切后的載體可以將載體5’端的磷酸基團(tuán)去掉，這樣載體就無法完成自連，從而在T4 DNA連接酶的作用下和目的片段連接，完成重組載體的構(gòu)建。

 

酶切酶連，雙酶切產(chǎn)生的黏性末端

在載體構(gòu)建過程中，如果使用兩種具有不同黏性末端的限制性內(nèi)切酶分別酶切目的片段和載體，就可以產(chǎn)生兩種不同的黏性末端。此時(shí)，T4 DNA連接酶可選擇性的將相同的黏性末端連接起來，從而確保目的片段以正確的方向接入載體。圖2中的目的片段和載體同時(shí)使用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ進(jìn)行酶切時(shí)，同樣的黏性末端才能彼此連接，目的片段和載體之間只存在一種連接方向。

圖2. 雙酶切產(chǎn)生的同種黏性末端連接^[1]

 

 

酶切連接，平末端

有的限制性內(nèi)切酶在酶切時(shí)也可以產(chǎn)生平末端，例如Sma I 等。T4 DNA連接酶可以直接在載體和目的片段之間形成磷酸二酯鍵，堿基之間不再需要配對，但是這種方式連接效率很低且容易發(fā)生載體自連。一般可以將平末端轉(zhuǎn)為轉(zhuǎn)成黏性末端后進(jìn)行連接，例如利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在目的片段和載體的末端上添加互補(bǔ)的多聚A和多聚T堿基，人工添加黏性互補(bǔ)末端，這種方式可以提高連接效率。

 

TA克隆

TA克隆中用到的T載體3’端有一個(gè)突出的T堿基，在不清楚目的片段DNA序列時(shí)，可以通過TA克隆的方式將將目的基因片段與T載體連接起來，最終測序確定目的基因序列。PCR中常用的Taq DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，可以在DNA片段的3’端添加一個(gè)核苷酸，通常為A。使用T4 DNA連接酶，即可將Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的產(chǎn)物與T載體進(jìn)行黏性末端互補(bǔ)連接，不需要再對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加接頭等處理即可達(dá)到高效克隆的目的。

圖3. TA克隆流程示意圖^[2]

 

 

 

2

NGS 接頭連接

在二代測序文庫構(gòu)建過程中，需要將人為構(gòu)建的接頭連接至PCR產(chǎn)物上，才能固定至測序芯片上的flowcell上完成測序。其中TA克隆連接接頭建庫是很常見的技術(shù)手段，它的原理與上述中TA克隆相似，待測序DNA片段在5'端磷酸化和3'端加“A”后，與帶“T”黏性末端的接頭互補(bǔ)配對，從而形成一個(gè)可上機(jī)測序的完整雙鏈。

 

在進(jìn)行TA連接時(shí)，不同樣本類型或核酸片段結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度都會影響到連接的效率，因此不同平臺的接頭也會有所影響。比如華大平臺的Bubble接頭，這種接頭具有特殊的二級結(jié)構(gòu)，對于T4 DNA 連接酶的連接效率要求非常高，而連接效率的降低直接影響到最終文庫的產(chǎn)出。

圖4. 一般接頭連接過程

 

翌圣T4 DNA連接酶助力NGS接頭連接

翌圣針對NGS建庫過程中DNA片段和接頭連接專門開發(fā)了Fast T4 DNA連接酶。該酶具有高效的連接能力，不僅連接速度快，而且兼容各類樣本，對于復(fù)雜結(jié)構(gòu)核酸片段的連接更顯優(yōu)勢。目前已經(jīng)過大量客戶的高通量測序驗(yàn)證，對于華大平臺的Bubble接頭的連接，也可得到穩(wěn)定的測序質(zhì)量。

 

翌圣Fast T4 DNA連接酶性能展示

1. 超高的連接效率：使用翌圣Fast T4 DNA連接酶進(jìn)行不同接頭類型末端的文庫構(gòu)建，樣本為170 bp cfDNA模擬物，使用Agilent 2100文庫檢測結(jié)果。未連接接頭產(chǎn)物；單端接頭連接產(chǎn)物；③雙端接頭連接產(chǎn)物；④殘留接頭。從結(jié)果可以看到單端以及雙端接頭的連接效率都非常高。

圖5. 不同類型連接產(chǎn)物通過Agilent 2100檢測結(jié)果圖

 

2. 優(yōu)異的文庫產(chǎn)量：使用Fast T4 DNA連接酶進(jìn)行不同種類文庫構(gòu)建，對比市面其他T4 DNA連接酶，都有更好的文庫產(chǎn)量。

 

表2. 不同種類樣本文庫產(chǎn)量

 

除了Fast T4 DNA連接酶，翌圣還有Novel T4 DNA連接酶、Quick T4 DNA 連接酶可供選擇。

 

表3.翌圣T4 DNA連接酶的選擇指南

產(chǎn)品定位	產(chǎn)品名稱	貨號	主要應(yīng)用
通用款	Quick T4 DNA Ligase (400 U/µL)	10301	分子克隆，NGS建庫等。
連接效率高，宿主大腸桿菌殘留低	Fast T4 DNA Ligase (400 U/µL)	10299	NGS建庫，特別適合病原檢測，NIPT檢測等。
靈敏度高	Novel T4 DNA Ligase (400 U/µL)	10298	NGS建庫，特別適合cfDNA樣本的建庫。

 

 

參考文獻(xiàn)

 

1. 袁婺洲.《基因工程（第二版）》:化學(xué)工業(yè)出版社，2019

2. Clark D P, Pazdernik N J, Mcgehee M R. Cloning Genes for Synthetic Biology - ScienceDirect[J]. Molecular Biology (Third Edition), 2019:199-239.

3. Tomkinson A E, Vijayakumar S, Pascal J M, et al. DNA Ligases: Structure, Reaction Mechanism, and Function[J]. Chemical Reviews, 2010, 37(21):no-no.

4. Shuman S. DNA Ligases: Progress and Prospects[J]. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(26):17365-17369.