Hieff NGS® EvoMax RNA Library Prep Kit（dNTP）是兼容Illumina和MGI雙平臺(tái)的Total RNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，本產(chǎn)品有常規(guī)管式和預(yù)裝板兩種規(guī)格，預(yù)裝板建庫(kù)試劑盒無需手動(dòng)配制或分裝，可直接適配自動(dòng)化上機(jī)建庫(kù)，使用更為便捷。試劑盒包含RNA片段化試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑，ds-cDNA合成試劑，以及文庫(kù)擴(kuò)增試劑?？梢糟暯觤RNA純化試劑盒或rRNA去除試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。所有試劑都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證，最大程度上保證了文庫(kù)構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

產(chǎn)品信息

貨號(hào)	12341ES24/12341ES96/12341ES97/12341ES98
規(guī)格	24 T/96 T/96 T（自動(dòng)化）/96 T（板式）

組分信息

產(chǎn)品組分	組分名稱	12341ES24	12341ES96	12341ES97 （管式自動(dòng)化96T）	12341ES98 (板式自動(dòng)化96T)
12341-A	Frag/Prime Buffer	450 μL	2×900 μL	2×1064 μL	8×266 μL
12341-B	1st Reaction Module 2.0	192 μL	768 μL	960 μL	8×120 μL
12341-C	2nd Reaction Module(dNTP)	840 μL	3×1120 μL	3×1280 μL	8×480 μL
12341-D	Ligation Reaction Module	840 μL	3×1120 μL	3×1280 μL	8×480 μL
12341-E	2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	600 μL	2×1200 μL	2×1360 μL	8×340 μL
*	Primer Mix*	/	/	/	/

注：* 標(biāo)注表示該成分不包含在本試劑盒，若建庫(kù)時(shí)，搭配短接頭，無需該組分；若建庫(kù)時(shí)搭配完整長(zhǎng)接頭，則需要額外配置，本試劑盒組分兼容Illumina和MGI雙平臺(tái)，但需要額外配置專屬于Illumina®或者M(jìn)GI®的primer mix(Cat# 13334 Primer Mix for MGI®以及Cat# 13335 Primer Mix for Illumina®)。

** 板式自動(dòng)化試劑組分排版情況見下圖。

圖：板式建庫(kù)試劑盒試劑組分排版圖

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

1.關(guān)于操作

1）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2）請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3）推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

4）請(qǐng)使用無RNase污染的耗材，并對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5）PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；配備文庫(kù)構(gòu)建專用移液器等設(shè)備；定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

6）若搭配移液工作站進(jìn)行自動(dòng)化建庫(kù)，可咨詢翌圣自動(dòng)化建庫(kù)流程。

7）板式試劑盒每孔試劑推薦開封后一次性使用。

8）本產(chǎn)品僅作科研用途！

2.關(guān)于接頭連接 (Adapter Ligation)

1）本公司可提供Illumina®或者MGI®長(zhǎng)接頭(Barcoded Adapter)試劑盒和短接頭試劑盒，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。

2）我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭。如客戶使用自制接頭，請(qǐng)委托具有NGS引物合成經(jīng)驗(yàn)的公司，并備注需進(jìn)行嚴(yán)格的防污染控制。此外，進(jìn)行接頭退火操作時(shí)，請(qǐng)?jiān)诔瑑襞_(tái)完成。每次只操作一種接頭，防止交叉污染。

3）使用接頭時(shí)，請(qǐng)?zhí)崆皩⒔宇^取出放在4℃或冰盒上解凍；在室溫操作時(shí)，實(shí)驗(yàn)室溫度最好不要超過25℃，防止接頭解鏈。

4）建庫(kù)過程中，接頭濃度過高或過低都會(huì)導(dǎo)致建庫(kù)成功率變低。本試劑板操作方案中，所加入的接頭體積固定為5 μL，請(qǐng)根據(jù)初始的RNA投入量，參考表1對(duì)接頭進(jìn)行稀釋。接頭稀釋液請(qǐng)選擇0.1×TE buffer，稀釋過的接頭可在4℃保存48小時(shí)。

表1-1 Input Total RNA量與Illumina®接頭使用濃度推薦表*

Input Total RNA	Illumina® Adapter stock concentration
10 ng	1 μM
100 ng	1.5 μM
500 ng	3 μM
≥1 μg	5 μM

表1-2  Input Total RNA量與MGI®接頭使用濃度推薦表*

Input Total RNA	MGI® Adapter stock concentration
10~99 ng	1 μM
100~499 ng	2 μM
500~4000 ng	5 μM

*可根據(jù)不同類型total RNA樣本及投入量，按需求適當(dāng)調(diào)整Adapter使用量

3.關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增 (Library Amplification)

1）本試劑盒中的文庫(kù)擴(kuò)增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成，在第一代的基礎(chǔ)上，大大增強(qiáng)了擴(kuò)增的均一性，即使是低拷貝的基因，也能進(jìn)行無偏好性地?cái)U(kuò)增。

2）文庫(kù)擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫(kù)產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導(dǎo)致文庫(kù)偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，Input Total RNA 量與相應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的推薦。

3）表2中推薦的循環(huán)數(shù)可滿足絕大多數(shù)建庫(kù)需求，若您的樣本質(zhì)量較差（如降解嚴(yán)重的FFPE樣本），可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)。mRNA建庫(kù)時(shí)請(qǐng)?zhí)貏e注意，由于不同物種和組織所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差異較大，實(shí)驗(yàn)中需根據(jù)建庫(kù)起始量、物種類型及樣本處理情況適當(dāng)調(diào)整擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

表2 Input Total RNA 量與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表*

Input Total RNA	Number of cycles
10 ng	16
100 ng	14
500 ng	11
1 μg	10

【注】：*由于文庫(kù)產(chǎn)量不僅與投入量和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)相關(guān)，樣本質(zhì)量、片段化條件、分選條件等都會(huì)影響產(chǎn)量。建庫(kù)過程中請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，選擇最合適的建庫(kù)條件。

4.DNA磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1）建庫(kù)過程中有多個(gè)步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進(jìn)行DNA純化和分選。

2）磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

3）磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4）轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量。

5）磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

6）產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7）DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4℃可保存2天，-20℃可保存1個(gè)月。

5.關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)

1）通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2）文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法。

3）推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫(kù)濃度檢測(cè)：Qubit®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對(duì)定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾。

4）文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop®等。

5）文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

6.自備材料 (Other Material)

1）mRNA富集試劑盒：Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat#12629)。

2）rRNA去除試劑盒：Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS)(Yeasen Cat#12257)或其他rRNA去除試劑盒。

3）RNA純化磁珠： Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)或其他等效產(chǎn)品。

4）DNA純化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效產(chǎn)品。

5）RNA質(zhì)控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產(chǎn)品。

6）Adapters：Complete Adapter for Illumina®使用（Cat#13519-13520或其他等效產(chǎn)品）或Complete Adapter for MGI®使用（Cat#13360-13362或其他等效產(chǎn)品）。

7. 文庫(kù)質(zhì)檢

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫(kù)定量試劑。

8. 其他材料

無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

建庫(kù)流程圖

圖1：RNA建庫(kù)流程