產(chǎn)品描述

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過(guò)氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。

目前有多種SOD活性測(cè)定方法，其中NBT（氮藍(lán)四唑）法和細(xì)胞色素C法都是常用的檢測(cè)方法。但WST-8法更為先進(jìn)，穩(wěn)定性更好、靈敏度更高。其基本檢測(cè)原理是：

黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)催化產(chǎn)生超氧化物陰離子，該超氧化物陰離子可以與WST-8反應(yīng)產(chǎn)生水溶性的甲臜(formazan)產(chǎn)物，而SOD可以抑制上述反應(yīng)。通過(guò)分析甲臜產(chǎn)物OD值，可計(jì)算SOD的酶活力。

檢測(cè)原理圖如下：

 

本試劑盒可以檢測(cè)細(xì)胞或組織勻漿液上清、全血、紅細(xì)胞抽提物、血清等多種生物樣品中的SOD活性。按照試劑盒提供使用步驟操作，1個(gè)試劑盒可供100次檢測(cè)。適合用于高通量篩選研究。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1）WST-8反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物；

2）WST-8法可以通過(guò)檢測(cè)單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光值測(cè)定SOD活力；

3）WST-8法測(cè)定時(shí)最大抑制百分率可以接近100%；

4）不受樣品中過(guò)氧化氫的干擾，本試劑盒通過(guò)添加適量過(guò)氧化氫酶等特殊方法，有效去除常規(guī)樣品中過(guò)氧化氫的干擾。

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)	組分名稱	組分規(guī)格
50105-A	SOD Assay Buffer  SOD檢測(cè)緩沖液	50 mL
50105-B	WST-8	800 µL
50105-C	Enzyme Solution 酶溶液	100 µL
50105-D	40×Initial Solution  40×反應(yīng)啟動(dòng)液	60 µL
50105-E	SOD樣品制備液	50 mL

運(yùn)輸和保存方法
 

冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期6個(gè)月?！咀ⅰ浚篧ST-8溶液需避光保存。

注意事項(xiàng)

1）待測(cè)樣品可-70℃保存一個(gè)月，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致SOD部分失活；

2）細(xì)胞或組織等樣品制備時(shí)不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液，會(huì)干擾檢測(cè)；

3）抗氧化物會(huì)對(duì)本試劑盒的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，例如0.1 mM ascorbic acid，5 mM GSH都會(huì)使測(cè)定出來(lái)的吸光度顯著升高。如果設(shè)置了使用說(shuō)明中的空白對(duì)照3，就可以消除樣品中的抗氧化物的干擾。

4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5）本產(chǎn)品僅作科研用途！

使用方法

1．樣品的制備

① 細(xì)胞樣品

1000-2000 g，4℃離心10 min收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS或生理鹽水洗滌1-2次。SOD樣品制備（按每1x106個(gè)細(xì)胞添加100~200 µL的SOD樣品制備液制備并適當(dāng)來(lái)回吹打使其充分裂解細(xì)胞），隨后4℃、12000g離心5 min，取上清待測(cè)。

② 組織樣品

動(dòng)物解剖前用生理鹽水（0.9% NaCl，含有0.16 mg/mL肝素鈉）灌流徹底清除紅細(xì)胞及血塊，取適量的組織樣品。于冰浴或是4℃環(huán)境中勻漿處理組織進(jìn)行SOD樣品制備（按每10 mg組織添加100 µL的SOD樣品制備液）。 隨后12000 g，4℃離心5 min，取上清待測(cè)。

③ 血漿或紅細(xì)胞樣品

用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃，600 g離心10 min，移取上清至新的1 mL離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)。紅細(xì)胞樣品可以參考步驟① 細(xì)胞樣品的制備方法，或其他不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。

【注】：a. 上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Yeasen 20201）測(cè)定蛋白濃度。通常10-20 µg蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會(huì)比較大，該活力范圍僅作參考)。每種樣品準(zhǔn)備20-100 µg蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測(cè)。
b. 根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測(cè)緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10-100倍。
c. 準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測(cè)定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測(cè)定，于-80℃凍存可保存至少1個(gè)月。但建議盡量當(dāng)天完成測(cè)定。注意反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致SOD部分失活。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作

① WST-8/酶工作液的配制

按照每個(gè)反應(yīng)160 μL的體積配置適量的WST-8/酶工作液。均勻混合151 μL SOD檢測(cè)緩沖液、8 μL WST-8和1 μL酶溶液，即可配置成160 μL WST-8/酶工作液。根據(jù)待檢測(cè)樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)品）的數(shù)量，配置適量的WST-8/酶工作液。配制好的WST-8/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

【注】：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當(dāng)混勻后再使用。

② 反應(yīng)啟動(dòng)工作液的配制

把試劑盒中的反應(yīng)啟動(dòng)液(40×) 融解后混勻，按照每1 μL反應(yīng)啟動(dòng)液(40×)加入39 μL SOD檢測(cè)緩沖液的比例進(jìn)行稀釋，混勻后即為反應(yīng)啟動(dòng)工作液。根據(jù)待檢測(cè)樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配置適量的反應(yīng)啟動(dòng)工作液。配制好的反應(yīng)啟動(dòng)工作液4℃或冰浴保存， 可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

③ （可選）SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備

需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的稀釋液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至以下系列濃度：200 U/mL，100 U/mL，50 U/mL，20 U/mL，10 U/mL，5 U/mL，2 U/mL。在隨后的檢測(cè)中可以各取20 µL，參考樣品進(jìn)行檢測(cè)。

【注】：為避免稀釋后SOD酶活性的下降， SOD標(biāo)準(zhǔn)品需現(xiàn)配現(xiàn)用；本試劑盒對(duì)于SOD的檢測(cè)并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照或作為對(duì)SOD活性定量的參考。

 

3. 樣品測(cè)定

① 參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對(duì)照孔。并按下表依次加入待測(cè)樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻。

【注】：加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后反應(yīng)即會(huì)開(kāi)始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差。

	樣品	空白對(duì)照1	空白對(duì)照2	空白對(duì)照3*
待測(cè)樣品	20 µL	/	/	20 µL
SOD檢測(cè)緩沖液	/	20 µL	40 µL	20 µL
WST-8/酶工作液	160 µL	160 µL	160 µL	160 µL
反應(yīng)啟動(dòng)工作液	20 µL	20 µL	/	/

【*】：如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì)，則需設(shè)置空白對(duì)照3；如果樣品沒(méi)有顏色并且也不含有抗氧化物則沒(méi)有必要設(shè)置空白對(duì)照3。

② 37℃孵育30 min?！咀ⅰ浚悍跤?5-35 min檢測(cè)出來(lái)的SOD活力無(wú)顯著差異，但為保證檢測(cè)結(jié)果的一致性，推薦孵育30 min。③ 在450 nm測(cè)定吸光度，如無(wú)450 nm濾光片，可以使用420-480 nm的濾光片?？梢允褂么笥?50 nm的波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。

4. 樣品中總SOD活力的計(jì)算

① 抑制百分率的計(jì)算

      參考如下計(jì)算公式計(jì)算抑制百分率：

      抑制百分率＝[(A空白對(duì)照1－A空白對(duì)照2)－(A樣品－A空白對(duì)照3)]/(A空白對(duì)照1－A空白對(duì)照2)×100%

      如果沒(méi)有設(shè)置空白對(duì)照3，則可以把計(jì)算公式簡(jiǎn)化為：

      抑制百分率＝(A空白對(duì)照1－A樣品)/(A空白對(duì)照1－A空白對(duì)照2)×100%

     【注】：盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)。如果計(jì)算出來(lái)的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測(cè)定。如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度較高的待測(cè)樣品。

  ② SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(unit)。

【注】：SOD活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進(jìn)行適當(dāng)換算。

  ③ SOD酶活力的計(jì)算

SOD酶活力的計(jì)算公式如下：

待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝檢測(cè)體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率) units

 例如，當(dāng)抑制百分率為50%時(shí)，待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；當(dāng)抑制百分率為60%時(shí)，待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。

④ 如果樣品為細(xì)胞或組織的勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細(xì)胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/g血紅蛋白或U/mg血紅蛋白。

其他SOD檢測(cè)參考方案

1：SOD酶活力計(jì)算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測(cè)到的抑制百分率對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計(jì)算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時(shí)不必使用本方案進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算。

此外，本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會(huì)因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品的保存問(wèn)題而導(dǎo)致實(shí)際酶活力下降。

2：SOD酶活力的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：如果條件許可，使用本試劑盒時(shí)也可以使用動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)SOD的酶活力。通常在【步驟3 ① 后可以37℃孵育同時(shí)在560 nm連續(xù)測(cè)定吸光度30 min。根據(jù)30 min內(nèi)的吸光度變化的斜率計(jì)算出抑制百分率：

抑制百分率＝[(斜率空白對(duì)照1－斜率空白對(duì)照2)－(斜率樣品－斜率空白對(duì)照3)]/(斜率空白對(duì)照1－斜率空白對(duì)照2)×100%

其余的計(jì)算方法同上述非動(dòng)力學(xué)的計(jì)算方法。動(dòng)力學(xué)方法的檢測(cè)和計(jì)算更加精確一些，但檢測(cè)起來(lái)相對(duì)要麻煩一些。

使用本試劑盒通常使用非動(dòng)力學(xué)方法即可。

HB181127