產(chǎn)品說明書
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產(chǎn)品簡介
Anti-Flag純化磁珠 ( Anti-DYKDDDDK（Flag）MagAgarose Beads)是一種聚合物磁性微球，由高質(zhì)量的鼠源抗DYKDDDDK（Flag）單克隆抗體與平均粒徑約為70 μm的瓊脂糖磁珠通過共價偶聯(lián)制備。瓊脂糖磁珠是采用天然高分子材料瓊脂糖與超順磁性材料復合形成的一種新型功能化磁性微球，具有更快的磁響應性同時保持微球良好的分散性、極低的非特異性吸附和更豐富的結合位點等特性，可用于Flag標簽蛋白的純化，也可用于帶有Flag標簽的蛋白免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。
Anti-Flag純化磁珠 ( Anti-DYKDDDDK（Flag）MagAgarose Beads)可結合Met修飾的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag融合蛋白（Protein-FLAG）。
產(chǎn)品性質(zhì)
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基質(zhì)（Matrix spherical） |
瓊脂糖磁珠 |
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配體（Ligand） |
鼠源抗Flag單克隆抗體 |
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結合能力（Binding Capacity） |
≥1.0 mg Flag標簽融合蛋白/mL磁珠 |
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粒徑（Particle size） |
30-100 μm |
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磁珠濃度（Concentration） |
磁珠懸浮于儲存保護液中，含量為20%（V/V) |
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儲存緩沖液（Storage Buffer） |
PBS, 0.01% Tween-20, 0.02% NaN3 |
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應用（Application） |
蛋白純化、IP、Co-IP |
儲存條件
2~8℃保存，有效期2年。
使用說明
- 緩沖液配制
【注】建議以下緩沖液在使用前用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜過濾。
裂解緩沖液：0.15 M NaCl, 50 mM Tris, 1% NP-40, pH7.4或WB/IP裂解液（Cat#20118ES）
平衡/結合/洗雜緩沖液：0.15 M NaCl, 50 mM Tris, pH7.4或1x TBS Buffer，TBS 緩沖液(粉末)，PH 7.4,1L（Cat#60157ES）
洗脫緩沖液（競爭洗脫）：平衡緩沖液溶解Flag多肽，終濃度為0.2-1 mg/mL
洗脫緩沖液（酸性洗脫）：0.1 M甘氨酸，pH 3.0
中和緩沖液：1 M Tris-HCl，pH 8.5
- 樣品準備
本操作說明書提供以下三種樣品處理方法，建議您根據(jù)不同來源的樣品選擇適當?shù)姆绞竭M行預處理，使待檢測蛋白釋放至樣品溶液中。
血清樣品處理：若目標蛋白豐度較高， 建議用結合緩沖液稀釋血清樣品至目標蛋白終濃度為50-150 µg/mL，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
懸浮細胞樣品處理：離心收集細胞（4℃, 1000 g, 5 min），用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM）。
混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。
貼壁細胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞兩遍；用細胞刮棒刮脫細胞，收集至1.5 mL EP管內(nèi)，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM）。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸?；靹蚝笾糜诒咸幚?/font>10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。
- 應用
1）蛋白純化，步驟如下：
a. 磁珠預處理
a）用移液器輕柔吹打Anti-Flag純化磁珠，使其充分混懸，依照所需純化的樣品量，取適量Anti-Flag純化磁珠懸液加入于離心管中，置于磁分離器上，磁性分離大約1 min，棄上清。
b）加入與懸浮液體積相同平衡緩沖液，并輕輕移液器混合，用移液器輕柔吹打重懸Anti-Flag純化磁珠，放置在磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄上清。重復洗2次。
b. 樣品結合
a）在預處理后的磁珠中加入含有Flag標簽的蛋白樣品，置于翻轉混合儀上孵育(常溫1~2 h，或4℃ 2~4 h，具體孵育時間可根據(jù)結合效果調(diào)整)；
b）將上述混合液置于磁力架上靜置，大約1 min，待溶液變澄清后，把上清液轉移到新的離心管中備用(上清可保留作為流穿液，用于電泳鑒定)，原離心管中剩余的即為蛋白-磁珠復合物；
c. 洗滌
a）向上述步驟所得的蛋白-磁珠復合物中加入5倍磁珠體積的洗雜緩沖液，輕柔混勻磁珠5~10 min，接著在磁力架上靜置，大約1 min，待溶液變澄清后后, 吸棄上清；重復3-5次（最后1次洗滌更換新離心管）
d. 蛋白洗脫
根據(jù)下游用途選擇洗脫方法。
a）競爭洗脫（Flag多肽洗脫）
加入3~5倍磁珠體積的競爭洗脫緩沖液（終濃度為0.2-1 mg/mLFlag多肽洗脫液），輕柔混勻磁珠，4℃孵育30 min（慢慢搖晃）, 分離磁珠上的磁珠并保存含有目標抗原的上清液，重復洗脫步驟一次以獲得更高的回收率。
b）酸性洗脫（0.1 M Gly-HCl，pH 3.0）
加入3~5倍磁珠體積的酸性洗脫緩沖液（0.1 M Gly-HCl，pH 3.0），輕柔混勻磁珠，室溫孵育5-10 min（慢慢搖晃），分離磁珠上的磁珠并保存含有目標抗原的上清液，上清液應立即用中和緩沖液（1 M Tris-HCl，pH 8.5）中和低pH。一般每100 μL洗脫液加入20 μL中和緩沖液。
注：酸性洗脫后磁珠要立即用平衡緩沖液平衡，Anti-Flag純化磁珠在酸性洗脫液中不要超過20 min。
2）免疫沉淀（IP），步驟如下：
a. 磁珠預處理
a）用移液器輕柔吹打Anti-Flag純化磁珠，使其充分混懸，取25~50 µL磁珠懸液置于1.5 mL離心管中。
b）加入500 µL 平衡緩沖液，并輕輕移液器混合，用移液器輕柔吹打重懸Anti-Flag純化磁珠，放置在磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄上清。重復洗2次。
b. 樣品結合
a）在預處理后的磁珠中加入含有Flag標簽的蛋白樣品，置于翻轉混合儀上孵育(常溫1~2 h，或4℃ 2~4 h，具體孵育時間可根據(jù)結合效果調(diào)整)；
b）將上述混合液置于磁力架上靜置，大約1 min，待溶液變澄清后，把上清液轉移到新的離心管中備用(上清可保留作為流穿液，用于電泳鑒定)，原離心管中剩余的即為蛋白-磁珠復合物；
c. 洗滌
a）向上述步驟所得的蛋白-磁珠復合物中加入1000 µL的洗雜緩沖液，輕柔混勻磁珠5~10 min，接著在磁力架上靜置，大約1 min，待溶液變澄清后后, 吸棄上清；重復2-3次
d. 蛋白洗脫
根據(jù)下游用途選擇洗脫方法。
a）競爭洗脫（Flag多肽洗脫）
加入100 μL競爭洗脫緩沖液（終濃度為0.2-1 mg/mL Flag多肽洗脫液），輕柔混勻磁珠，4℃孵育30 min（慢慢搖晃）, 分離磁珠上的磁珠并保存含有目標抗原的上清液，重復洗脫步驟一次以獲得更高的回收率。
b）酸性洗脫（0.1 M Gly-HCl，pH 3.0）
加入100 μL酸性洗脫緩沖液（0.1 M Gly-HCl，pH 3.0），輕柔混勻磁珠，室溫孵育5-10 min（慢慢搖晃），分離磁珠上的磁珠并保存含有目標抗原的上清液，上清液應立即用中和緩沖液（1 M Tris-HCl，pH 8.5）中和低pH。一般每100 μL洗脫液加入20 μL中和緩沖液。
注：酸性洗脫后磁珠要立即用平衡緩沖液平衡，Anti-Flag純化磁珠在酸性洗脫液中不要超過20 min。
c）用SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫
如需直接檢測目的蛋白，則在上述洗滌過的蛋白-磁珠復合物中加入80~100 μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸 10 min，冷卻至室溫并在磁力架上分離磁珠，取上清進行 SDS-PAGE 檢測。
注意事項
1. 請勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會導致磁珠聚集而降低結合能力。
2. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20241118
