microRNA是一類被廣泛關(guān)注的非編碼RNA，長度為22 nt左右，對植物和動物的基因表達有著非常重要的調(diào)控作用。本試劑盒采用加A尾法來進行miRNA第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)品中的2×Hifair^® miRNA RT buffer包含了miRNA加A尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的所有原料和引物，并經(jīng)過精心優(yōu)化，可保證miRNA 3'末端的Poly(A)修飾過程和逆轉(zhuǎn)錄過程同時高效進行。后續(xù)qPCR中只需設(shè)計特異性正向引物，配合試劑盒中的通用反向引物，即可對樣本中的miRNA進行檢測。此外，試劑盒中提供了人、大鼠、小鼠通用的 U6 內(nèi)參上下游引物，可在寬廣的區(qū)域內(nèi)得到良好的標準曲線。

本產(chǎn)品推薦與本公司的Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat#11171）配套使用，以獲得最優(yōu)的實驗結(jié)果。

 

產(chǎn)品組分

組分編號	組分名稱	產(chǎn)品編號/規(guī)格
		11148ES10(10 T)	11148ES50(50 T)
11148-A	Hifair® miRNA RT enzyme mix	17.5 μL	87.5 μL
11148-B	2×Hifair® miRNA RT buffer	50 μL	250 μL
11148-C	RNase-free H2O	2 mL	10 mL
11148-D	Universal Reverse Primer (10 μM)	800 μL	4 mL
11148-E	U6 Forward Primer (10 μM)	100 μL	500 μL
11148-F	U6 Reverse Primer (10 μM)	100 μL	500 μL

 

運輸與保存方式

冰袋運輸。-20℃保存，有效期1年。

 

操作步驟

一、體系配制

室溫融化Hifair^® miRNA RT enzyme mix和2×Hifair^® miRNA RT buffer后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系：

組分	體積 (μL)	終濃度
2×Hifair® miRNA RT buffer	5	1×
Hifair® miRNA RT enzyme mix	1.75	-
RNA*	-	X
RNase-free H2O	Up to 10	-

*總RNA及提取的miRNA的濃度范圍10 pg-2 μg，合成的miRNA拷貝數(shù)最低可達60 copies，投入體積不超過3.25 μL。

 

二、逆轉(zhuǎn)錄程序

移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，按下表程序進行miRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

反應(yīng)溫度	反應(yīng)時間	備注
37℃	50 min	miRNA加A尾及反轉(zhuǎn)錄過程
85℃	5 sec	酶失活過程

【注】：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進行下游qPCR檢測。為避免逆轉(zhuǎn)錄體系對qPCR反應(yīng)的抑制，可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內(nèi)不進行下游實驗，可放置于-20℃保存。若長期保存，建議分裝后，于-80°C保存，避免反復(fù)凍融。

 

注意事項

1）使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。

2）實驗時，請使用無RNase污染的耗材，避免不必要的損失影響實驗結(jié)果。

3）本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融，配制時應(yīng)避免強光照射。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5）本產(chǎn)品僅作科研用途！

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