產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻
microRNA是一類被廣泛關(guān)注的非編碼RNA，長度為22 nt左右，對植物和動物的基因表達有著非常重要的調(diào)控作用。本試劑盒采用SYBR® Green I嵌合熒光法的原理進行miRNA熒光定量檢測。本產(chǎn)品中的2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix是專門為miRNA定量檢測而研發(fā)的新一代預混形式的熒光定量PCR檢測試劑，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調(diào)整ROX的濃度，只需在配制反應體系時加入引物和模板即可進行擴增。DNA Polymerase采用化學修飾的熱啟動聚合酶，配合特殊的Buffer體系，使反應特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內(nèi)進行準確定量。
本產(chǎn)品必須與本公司的Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（加A法）(Cat#11148ES)配套使用，以獲得最終的實驗結(jié)果。
產(chǎn)品組分
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組分編號 |
組分名稱 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
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11171ES03 (20 μL×100 rxn) |
11171ES08 (20 μL×500 rxn) |
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11171-A |
2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix |
1 mL |
5×1 mL |
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11171-B |
RNase-free H2O |
2×1 mL |
5×1 mL |
運輸與保存方式
冰袋運輸。-20℃避光保存，有效期1年。
需自備的試劑及耗材
1）無核酸酶污染的槍頭及離心管。
2）PCR上游引物（Forward Primer）。
Forward Primer設(shè)計原則
通常以成熟的miRNA序列為基礎(chǔ)，將U替換成T。Tm值建議在65℃左右?？蛇m當在引物的5’端添加若干個G或C堿基以增加Tm值，也可適當在5’或3’端去掉若干堿基以減少Tm值，注意避免引入二級結(jié)構(gòu)。
注意事項
1）使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
2）實驗時，請盡量使用無污染的耗材，避免污染。
3）本產(chǎn)品避免反復凍融，配制時應避免強光照射。
4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
5）本產(chǎn)品僅作科研用途！
操作步驟
一、體系配制
1）將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免起泡。
2）將試劑置于冰上，按照下表配制試劑。RNase-free H2O可替換為其他用于分子生物學實驗的無核酸酶水。
【注】：沒有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會導致反應性能下降。
3）熒光定量PCR體系配制
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組分 |
體積 (μL) |
體積 (μL) |
終濃度 |
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2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix |
10 μL |
25 μL |
1 × |
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Forward Primer（自備） |
X |
X |
400 nM |
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Reverse Primer (10 μM) |
0.8 μL |
2 μL |
400 nM |
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cDNA |
X |
X |
- |
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RNase-free H2O |
Up to 20 μL |
Up to 50 μL |
- |
【注】：a) miRNA第一鏈cDNA的加入量不要超過qRT-PCR體積的1/10。高濃度cDNA易導致非特異擴增，可對cDNA適當稀釋10-1000倍。
b) Reverse Primer (10 μM) 來源于試劑盒11148ES。由于專利的保密性，miRNA加A法反轉(zhuǎn)錄后，cDNA下游引物序列不同廠商之間存在差異，建議使用翌圣加A法反轉(zhuǎn)錄試劑盒11148ES，以保證最終的實驗結(jié)果。
二、PCR反應程序設(shè)置
可參考以下兩個程序進行定量PCR反應。
a. 熒光定量PCR常規(guī)擴增程序（兩步法）
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
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預變性 |
95℃ |
10 min |
1 |
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變性 |
95℃ |
15 sec |
35-40 |
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退火/延伸 |
60℃ |
20 sec |
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熔解曲線階段 |
儀器默認設(shè)置 | 1 | |
b. 熒光定量PCR快速擴增程序（兩步法）
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
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預變性 |
95℃ |
10 sec |
1 |
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變性 |
95℃ |
5 sec |
40 |
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退火/延伸 |
60℃ |
20 sec |
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熔解曲線階段 |
儀器默認設(shè)置 |
1 |
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【注】：
1）退火/延伸溫度和時間可根據(jù)實驗要求適當調(diào)整。
2）常規(guī)程序與快速程序根據(jù)實驗儀器選擇，例如：ABI QuantStudio 5等儀器可以進行快速程序設(shè)置，Bio-Rad CFX96等儀器不可設(shè)置快速程序，需要進行常規(guī)程序設(shè)置。
HB221202
