產(chǎn)品描述

HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)方法偶聯(lián)四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni²⁺）后，形成非常穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu)，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結(jié)構(gòu)可保護(hù)鎳離子免受小分子的進(jìn)攻，更加穩(wěn)定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件。此外，因其基質(zhì)的耐壓性（該基質(zhì)可以耐受最高0.3 MPa的壓力），該產(chǎn)品可以用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化，可在相對(duì)較高的流速下，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的純化。

HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column是一種以HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF為填料的中壓預(yù)裝柱，該預(yù)裝柱具有標(biāo)準(zhǔn)接口，可以適配商品化的各類中壓色譜系統(tǒng)，如ÄKTA等，方便客戶用于純化His-tag蛋白。

 

產(chǎn)品性質(zhì)

基質(zhì)（Matrix）	高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠
粒徑（Bead size）	45-165 µm
載量（Capacity）	＞40 mg 6×His-tagged protein/mL 基質(zhì)
耐壓（Tolerance Pressuremax）	0.3 Mpa，3 bar
儲(chǔ)存緩沖液（Buffer）	含20%乙醇的1×PBS
柱子尺寸（Column Size）	0.7×2.5 cm（1mL）

 

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。4℃保存。有效期2年。

 

注意事項(xiàng)

1）建議純化所用緩沖液和蛋白溶液經(jīng)0.22 µm或0.45 µm濾膜過(guò)濾后上柱使用。

2）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

（一）純化流程

1 緩沖液的準(zhǔn)備

緩沖液使用原理：低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。Buffer 在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過(guò)濾除菌?？扇苄越M氨酸標(biāo)簽蛋白純化所需配方詳見(jiàn)附表1。包涵體組氨酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方詳見(jiàn)附表2。

2 樣品準(zhǔn)備

2.1 細(xì)菌表達(dá)的蛋白（本說(shuō)明以細(xì)菌表達(dá)蛋白為例）

1）挑取單菌落到含有適合抗性的LB培養(yǎng)基中，根據(jù)載體說(shuō)明加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間。

2）表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至離心瓶，7000 rpm，離心15 min，收集菌體，然后加入1/10體積的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其終濃度為1 mM），同時(shí)也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹(shù)脂的結(jié)合。

3）之后加入溶菌酶，使其工作濃度為1 mg/mL?！咀ⅰ咳绻磉_(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。

4）將菌體沉淀懸浮起來(lái)（如果菌液濃度高，可考慮加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混勻，置于冰上超聲破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

5）收集上述澄清蛋白液，10000 rpm，4℃離心20-30 min。取上清，0.22 µm/0.45 µm濾膜過(guò)濾后，置于冰上備用或-20℃保存。

2.2 酵母、昆蟲(chóng)和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)的可溶性蛋白

將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心瓶，5000 rpm離心10 min，收集上清。如上清中不含EDTA、組氨酸和還原劑等，即可直接上柱純化；如含有EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，則需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。

【注】對(duì)于大量體積的上清，需加入硫酸銨進(jìn)行沉淀濃縮，之后經(jīng)1×PBS 4℃下透析后上柱。

2.3 包涵體蛋白純化（以細(xì)菌為例）

1）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心瓶，7000 rpm，離心15 min，收集菌體去上清。

2）按照菌體：裂解液=1:10（w/v）的比例將菌體充分懸浮，混勻，冰浴超聲破碎。

3）將破碎液轉(zhuǎn)移至離心管，10000 rpm，4℃離心20-30 min，去上清?？芍貜?fù)步驟2）和3）一次。

4）按照菌體：裂解液（含8 M尿素）=1:10（w/v）的比例將包涵體充分懸浮。

5）變性條件下純化His標(biāo)簽蛋白純化。

3 樣品純化（以AKTA使用為例）

1）將泵管道注滿去離子水。去掉產(chǎn)品上塞，連接至色譜系統(tǒng)中，再折斷下口，將預(yù)裝柱連接到色譜系統(tǒng)中，注意旋緊。

2）3-5倍柱體積去離子水沖洗出存儲(chǔ)緩沖液。

3）至少5倍柱體積的Lysis Buffer 平衡色譜柱。推薦流速為1 mL/min。

4）利用泵或注射器上樣?！咀ⅰ咳魳悠氛扯仍黾?，即使上樣體積很少也會(huì)導(dǎo)致層析柱很大的反壓；上樣量不要超過(guò)柱子的結(jié)合能力；大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進(jìn)樣器更難使用。

5）Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的基線（一般至少10-15個(gè)柱體積）。

  【注】在樣品和結(jié)合緩沖液中加入低濃度咪唑可以提高樣品純度。

6）Elution Buffer一步法或梯度法進(jìn)行洗脫。一步法洗脫中一般5倍柱體積洗脫液即可。梯度洗脫可以用一個(gè)小的梯度，例如20倍柱體積或更多來(lái)分離不同結(jié)合強(qiáng)度的蛋白質(zhì)。

7）建議用更高濃度咪唑（如500 mM）徹底清洗純化柱上結(jié)合的雜蛋白。隨后依次用3倍柱體積的Lysis Buffer和5倍柱體積的去離子水清洗樹(shù)脂。5倍柱體積的20%乙醇平衡樹(shù)脂，置于4℃保存。

4 SDS-PAGE檢測(cè)

將純化過(guò)程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，判定其純化效果。

 

（二）在位清洗

當(dāng)填料使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)反壓過(guò)高（＞0.5 Mpa）或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時(shí)，需對(duì)其進(jìn)行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗時(shí)，先把Ni²⁺脫掉，清洗結(jié)束后，將填料保存在20%乙醇中，后者重新掛Ni后再保存在20%乙醇中。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白，脂蛋白和脂類

使用30%異丙醇清洗5-10個(gè)柱體積，接觸時(shí)間為15-20 min可以去除此類污染物。之后再用去離子水清洗10倍柱體積。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或者堿性溶液清洗填料2倍柱體積。例如含有0.1-0.5%非離子去污劑的0.1 M醋酸溶液，接觸時(shí)間為1-2 h。去污劑處理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱體積，徹底去除去污劑。最后利用去離子水清洗10倍柱體積。

2 去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用1.5 M NaCl 溶液接觸10-15 min，之后用去離子水清洗10倍柱體積。

 

（三）填料再生

當(dāng)填料使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)反壓過(guò)高（＞0.5 Mpa），填料上面出現(xiàn)明顯的污染，或填料載量明顯變低時(shí)，需要對(duì)其進(jìn)行鎳離子剝離及重新掛鎳處理，即填料再生。按照下面操作流程進(jìn)行：

1）使用5倍柱體積去離子水清洗填料；

2）使用5倍柱體積100mM EDTA（pH 8.0）剝落鎳離子；

3）使用10倍柱體積去離子水清洗填料；

4）使用0.5M NaOH清洗5倍柱體積，停留10-15min；

5）使用10倍柱體積去離子水清洗填料；

6）使用3-5倍柱體積100mM NiSO₄再生掛鎳；

7）去離子水清洗10倍柱體積。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃?zhèn)溆谩?/font>

 

附表1 可溶性His標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer (pH8.0)	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8 g NaCl             17.54 g Imidazole         0.68 g
Wash Buffer (pH8.0)	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8 g NaCl             17.54 g Imidazole         1.36 g
Elution Buffer(pH8.0)	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8 g NaCl             17.54 g Imidazole         17.0 g

附表2 包涵體His標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer，pH8.0	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	Urea             480.5 g NaH2PO4 ·2H2O    15.6 g Tris              15.76 g
Wash Buffer，pH6.3	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調(diào)pH至6.3，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	Urea             480.5g NaH2PO4 ·2H2O    15.6g Tris              15.76g
Elution Buffer，pH4.5	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調(diào)pH至4.5，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	Urea             480.5 g NaH2PO4 ·2H2O    15.6 g Tris              15.76 g