His-tag蛋白純化磁珠是一種高容量的新型磁性微球產(chǎn)品，用于快速、高效的純化 His標(biāo)簽融合蛋白。磁珠在磁場(chǎng)作用下直接從生物樣品中可一步純化出高達(dá)95%純度的目的蛋白，極大的簡(jiǎn)化了純化工藝和提高純化效率。將含有His標(biāo)簽蛋白的細(xì)胞裂解物添加到MagBeads 中，讓蛋白質(zhì)與其充分結(jié)合，然后可從磁珠中洗脫分離出目的蛋白。

與傳統(tǒng)柱層析方法相比，使用磁珠純化His標(biāo)簽蛋白無(wú)需控制上樣流速和多次離心樣品，也不需要昂貴的層析和離心設(shè)備。樣品與磁珠的結(jié)合以及目的蛋白與磁珠的分離簡(jiǎn)單、快捷，而且更容易實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化的蛋白純化方法。適合科研和工業(yè)客戶高通量地進(jìn)行組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化。

該磁珠以4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)通過(guò)化學(xué)方法偶聯(lián)了四配位的氮川三乙酸(NTA)，螯合鎳離子(Ni²⁺)后，可以形成非常穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu)，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結(jié)構(gòu)很有效的保護(hù)了鎳離子免受小分子的進(jìn)攻更加穩(wěn)定。

His標(biāo)簽蛋白純化磁珠廣泛適用于細(xì)菌、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等分泌或胞內(nèi)表達(dá)的可溶性組氨酸標(biāo)簽蛋白，也可用于變性蛋白的純化（包涵體需變性后再進(jìn)行純化）。

翌圣為您提供蛋白純化實(shí)驗(yàn)整體解決方案，相關(guān)產(chǎn)品選購(gòu)請(qǐng)參考：蛋白純化系列產(chǎn)品-選購(gòu)指南

 

產(chǎn)品性質(zhì)

基質(zhì)	磁性瓊脂糖微球
載量	> 40 mg 6×His-tagged protein/mL磁珠
粒徑	30-100 μm
磁珠濃度	磁珠懸浮于保護(hù)液中，含量為20%（V/V)
儲(chǔ)存緩沖液	含20%乙醇的1×PBS

 

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。4℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存，有效期2年。

 

注意事項(xiàng)

1.磁珠保存過(guò)程中避免冷凍、干燥和高速離心等操作。

2.磁珠使用前，請(qǐng)充分震蕩，使磁珠保持均勻的懸浮狀態(tài)。

3.使用過(guò)的磁珠重復(fù)使用時(shí)，建議純化同一種蛋白，純化不同種蛋白時(shí)，建議使用新磁珠，以避免交叉污染。

4.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5.本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

使用方法

一、緩沖液配制

1.緩沖液使用基本原理：低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。

2.Buffer在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm濾膜過(guò)濾除菌。

3.可溶性蛋白純化所需緩沖液及配方詳見附表1，包涵體蛋白純化所需緩沖液及配方詳見附表2和表3。

 

二、樣本制備

2.1細(xì)菌或酵母表達(dá)的蛋白

1）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7,000 rpm (7,500 xg)，離心15 min收集菌體，然后按照菌體：Lysis Buffer=1: 10 （W/V）加入Lysis Buffer，加入終濃度為1 mM的PMSF。同時(shí)可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與磁珠的結(jié)合。

2）加入溶菌酶,使其工作濃度為0.2-0.4 mg/mL。如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶。

3）將菌體沉淀懸浮起來(lái)，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10 μg/mL RNase A和5 μg/mL DNase I）,混勻，冰上超聲破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

4）將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10,000 rpm (15,000 xg)，4℃離心20-30 min。 取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

2.2酵母、昆蟲和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)可溶性蛋白

1）將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心杯中，5,000 rpm (3,800 xg)，離心10 min，收集菌體得上清，如上清中不含EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，即可直接使用；如含有EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，需用Lysis Buffer透析才能上樣。

2）對(duì)于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，然后用Lysis Buffer透析后才能上樣。

2.3包涵體蛋白純化（變性條件）

1）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7,000 rpm (7,500 xg)，離心15 min收集菌體，去掉上清。

2）按照菌體：Lysis buffer（不含8M尿素）=1:10 (W/V)將菌體懸浮起來(lái)，混勻，冰浴超聲破碎。

3）將破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10,000 rpm (15,000 xg)，4℃離心20-30 min。去掉上清，步驟2和3可以重復(fù)一次。

4）按照菌體：Lysis buffer（含8M尿素）=1:10 (w/v)的比例將包涵體充分懸浮。

 

三、磁珠預(yù)處理

3.1 準(zhǔn)備

將磁珠充分混勻，使用移液器取適量的磁珠懸浮液，置于離心管中，將離心管置于磁力架上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄上清。

3.2平衡

將離心管從磁力架上取下來(lái)，加入與懸浮液等體積的Lysis Buffer，使用槍頭反復(fù)吹打5-10次，將離心管置于磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄清液，重復(fù)洗滌2次。

 

四、磁珠與目的蛋白結(jié)合

4.1 結(jié)合

將含有目的蛋白的上清液加入到處理好的磁珠中，顛倒混勻。將離心管置于混合儀上，室溫旋轉(zhuǎn)孵育30 min （如果目標(biāo)蛋白不穩(wěn)定，建議2-8℃下孵育1 h）。

4.2 洗雜

將離心管置于磁分離器，待溶液變澄清后，用移液器移出上清液，保留上清液，以備取樣檢測(cè)。向離心管中加入2倍懸浮液體積的Wash Buffer，使用槍頭反復(fù)吹打5-10次，將離心管置于磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸取上清液，保留，以備取樣檢測(cè)。重復(fù)上述步驟2次。

4.3 洗脫

建議將3-5倍磁珠體積的Elution Buffer加入到離心管中，使用移液器輕輕吹打3-5次，混勻，將離心管置于磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸取上清液，即為目的蛋白。如有需要，可以重復(fù)上述步驟1次，以提高目的蛋白的回收量。用戶也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整緩沖液中的咪唑濃度。

 

五、磁珠保存

1. 向裝有磁珠的離心管中加入1 mL Elution Buffer，用移液器反復(fù)吹打3-5次，使磁珠充分懸浮，然后置于磁分離器，吸棄上清，重復(fù)該操作2次。

2. 向離心管中加入1 mL去離子水，用移液器反復(fù)吹打3-5次，使磁珠充分懸浮，然后置于磁分離器，吸棄上清，重復(fù)該操作2次。

3. 向離心管中加入含20%乙醇的1×PBS，使總體積為磁珠初始懸浮液體積，保存于2-8 ℃。

 

六、SDS-PAGE 檢測(cè)

將純化得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分）使用SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

 

表1. 可溶性His標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer	50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         0.68 g
Wash Buffer	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         1.36 g
Elution Buffer	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         17.0 g

以上緩沖液適用于多數(shù)His標(biāo)簽蛋白的純化，客戶也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整緩沖液中的咪唑濃度。

 

表2. 包涵體His標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方,pH洗脫方式

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	Urea             480.50 g NaH2PO4 ·H2O     13.80 g Tris·Cl            12.10 g
Wash Buffer	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調(diào)pH至6.3，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	Urea             480.50 g NaH2PO4 ·H2O     13.80 g Tris·Cl            12.10 g
Elution Buffer	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調(diào)pH至4.5，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	Urea             480.50 g NaH2PO4 ·H2O     13.80 g Tris·Cl            12.10 g

 

 

表3. 包涵體His標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方,咪唑洗脫方式

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer	8 M Urea 50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	Urea             480.50 g NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         0.68 g
Wash Buffer	8 M Urea 50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌	Urea             480.50 g NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         1.36 g

 

Elution Buffer

8 M Urea 50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH調(diào)pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過(guò)濾除菌

Urea             480.50 g NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         17.0 g

 

表4. Ni NTA Magarose Beads試劑耐受情況

試劑種類	濃度
還原劑	5 mM DTE 1 mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione
變性劑	8 M urea 6 M Gua-HCl
去污劑	2% TritonTM X-100, nonionic 2% TweenTM20, nonionic 2% NP-40, nonionic 2% Cholate, anionic 1% CHAPS, zwitterionic
其他類	500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate

 

HB220315