SV40LTA&E1A Residue DNA Detection Kit SV40LTA&E1A殘留DNA檢測(cè)試劑盒
批量采購(gòu)， 請(qǐng)點(diǎn)擊詢(xún)價(jià)
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
SV40LTA&E1A殘留DNA檢測(cè)試劑盒是用于定量分析檢測(cè)生物制品中宿主細(xì)胞，如HEK293T細(xì)胞系中的SV40LTA和E1A殘留DNA含量的試劑盒。
本試劑盒采用探針?lè)晒舛?/font>PCR原理，可專(zhuān)一快速的檢測(cè)樣品中SV40LTA和E1A殘留DNA，其最低檢測(cè)限可以達(dá)到101 copies/μL水平。該試劑盒可與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。
產(chǎn)品組分
|
組分編號(hào) |
組分名稱(chēng) |
產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格 |
|
|
41310ES50 (50T) |
41310ES60 (100T) |
||
|
41310-A |
SV40LTA&E1A qPCR Mix |
0.75 mL |
1.5 mL |
|
41310-B |
SV40LTA&E1A Primer&Probe Mix |
200 μL |
400 μL |
|
41310-C |
DNA Dilution Buffer |
2×1.8 mL |
4×1.8 mL |
|
41310-D |
SV40LTA&E1A DNA Control (nonliner) |
25 μL |
50 μL |
|
41310-E |
SV40LTA&E1A DNA Control (linear) |
25 μL |
50 μL |
|
41310-F |
IC |
50 μL |
100 μL |
【注】：1. IC：Internal control，內(nèi)部對(duì)照。
運(yùn)輸和保存方法
1. 所有組分均干冰運(yùn)輸，-25~-15℃保存，有效期2年。且41310-A和41310-B均需避光保存。
2. 收到貨后，請(qǐng)檢查共6個(gè)組分是否齊全，并立即放入對(duì)應(yīng)的保存溫度中儲(chǔ)存。
注意事項(xiàng)
1. 使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書(shū)，實(shí)驗(yàn)應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。
2. 每個(gè)組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。
3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
4. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
適用機(jī)型
包含但不限于以下儀器：
Bio-Rad：CFX96 Optic Module；
Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5，ABI Step OnePlus；
上海宏石醫(yī)療科技：SLAN-96S。
使用方法
一、SV40LTA&E1A DNA定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備
已知，線(xiàn)性化和非線(xiàn)性化的SV40LTA&E1A DNA Control濃度都是一樣的，且各自內(nèi)含有的SV40LTA濃度均為1.8×107 copies/μL，E1A濃度均為1.8×107 copies/μL。建議根據(jù)實(shí)際樣品結(jié)構(gòu)特性，選擇線(xiàn)性化或非線(xiàn)性化SV40LTA&E1A DNA Control配制標(biāo)曲。具體操作如下：
1.將SV40LTA&E1A DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。
2. 取6支干凈的1.5 mL離心管，分別標(biāo)記為Std0，Std1，Std2，Std3，Std4，Std5。
3. 在標(biāo)記為Std0的1.5 mL離心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL SV40LTA&E1A DNA Control，將SV40LTA&E1A定量參考品稀釋10倍，得到Std0（SV40LTA濃度1.8×106 copies/μL，E1A濃度1.8×106 copies/μL），振蕩混勻后短時(shí)間快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-20℃短期保存（不超過(guò)3個(gè)月），使用時(shí)避免反復(fù)凍融。
4. 在Std1，Std2，Std3，Std4，Std5管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer，再進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)♂尫椒ㄈ缦拢?/font>
|
稀釋管 |
稀釋比例 |
終濃度(copies/μL) |
|
|
SV40LTA (liner/nonliner) |
E1A (liner/nonliner) |
||
|
Std1 |
10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.8×105 |
1.8×105 |
|
Std2 |
10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.8×104 |
1.8×104 |
|
Std3 |
10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.8×103 |
1.8×103 |
|
Std4 |
10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.8×102 |
1.8×102 |
|
Std5 |
10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.8×101 |
1.8×101 |
【注】：
1. 每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，該試劑可測(cè)試1.8×101-1.8×105 copies/μL線(xiàn)性范圍的SV40LTA和對(duì)應(yīng)的1.8×101-1.8×105 copies/μL線(xiàn)性范圍的E1A。
2. 為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時(shí)將DNA定量參考品分裝儲(chǔ)存于-20℃。
3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天，若長(zhǎng)時(shí)間不用，請(qǐng)放置于-20℃。
4. 為確保模板完全混勻，每個(gè)梯度稀釋時(shí)需輕微震蕩混勻約1 min。
二、樣本加標(biāo)回收質(zhì)控ERC的制備
根據(jù)需要設(shè)置ERC中的SV40LTA&E1A DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度（以制備加1.8×103 copies SV40LTA對(duì)應(yīng)1.8×103copies E1A DNA量的ERC為例），具體操作如下：
1. 取100 μL待測(cè)樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL Std4，混勻，標(biāo)記為ERC。
2. 加標(biāo)回收ERC和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備加標(biāo)回收ERC純化液。
三、陰性抽提質(zhì)控NCS的制備
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性抽提質(zhì)控NCS，具體操作如下：
1. 取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標(biāo)記為NCS。
2. 陰性質(zhì)控NCS和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。
四、無(wú)模板對(duì)照NTC的制備
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置無(wú)模板對(duì)照NTC，具體操作如下：
1. 無(wú)模板對(duì)照NTC無(wú)需進(jìn)行樣本前處理，在qPCR法檢測(cè)殘留DNA含量階段開(kāi)始配置即可。
2. 每管或孔中的NTC反應(yīng)體系為20 μL Mix混合液（即15 μL SV40LTA&E1A qPCR Mix + 4μL SV40LTA&E1A Primer&Probe Mix+ 1μL IC）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個(gè)重復(fù)孔的量。
五、反應(yīng)體系
|
組分 |
體積(μL) |
|
SV40LTA&E1A qPCR Mix |
15 |
|
SV40LTA&E1A Primer&Probe Mix |
4 |
|
IC |
1 |
|
DNA template |
10 |
|
總體積 |
30 |
【注】：
1.根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需Mix混合液總量：Mix混合液=（反應(yīng)孔數(shù)+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。
2. 反應(yīng)孔數(shù)=（5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)+1個(gè)無(wú)模板對(duì)照NTC+1個(gè)陰性抽提質(zhì)控NCS+待測(cè)樣本TS個(gè)數(shù)+待測(cè)樣本對(duì)應(yīng)加標(biāo)回收ERC個(gè)數(shù)）× 3。
NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer
NCS (Negative Control Solution)：樣本基質(zhì)溶液或DNA Dilution Buffer進(jìn)行樣本前處理后，所得純化液為NCS
TS (Test Sample)：待測(cè)樣本
ERC (Extraction Recovery Control)：待測(cè)樣本中加入如1.8×103 copies SV40LTA對(duì)應(yīng)1.8×103copies E1A標(biāo)準(zhǔn)品DNA后進(jìn)行樣本前處理，所得純化液為加標(biāo)回收ERC
3. 加樣完成密封好管子后，請(qǐng)低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應(yīng)液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。
下圖為參考板位：
該示例是對(duì)SV40LTA&E1A殘留DNA qPCR法檢測(cè)操作的展示，檢測(cè)樣本包括：5個(gè)濃度梯度SV40LTA&E1A DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、1個(gè)無(wú)模板對(duì)照NTC、1個(gè)陰性質(zhì)控NCS、3個(gè)待測(cè)樣本TS、3個(gè)樣本加標(biāo)回收ERC。建議每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。
六、擴(kuò)增程序參數(shù)設(shè)置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.4為例）
1.創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對(duì)定量檢測(cè)模板。
2.創(chuàng)建2個(gè)檢測(cè)探針，第一個(gè)命名為“SV40LTA-DNA”，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“FAM”，猝滅熒光基團(tuán)為“none”；第二個(gè)命名為“E1A-DNA”，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“VIC”，猝滅熒光基團(tuán)為“none”；再創(chuàng)建1個(gè)檢測(cè)探針，命名為“IC”，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“CY5”，猝滅熒光基團(tuán)為“none”。參比熒光為“ROX”（參比熒光可根據(jù)儀器型號(hào)等情況，選擇是否需要添加）。
3.在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)孔“Task”一欄設(shè)置為“Standard”，并且在“Quantity”一欄分別賦值FAM通道“180000”，“18000”，“1800”，“180”，“18”，VIC通道“180000”，“18000”，“1800”，“180”，“18”（含義為每孔的DNA濃度，單位為copies/μL），并且在相應(yīng)的“sample name”一欄中命名為“Std1”，“Std2”，“Std3”，“Std4”，“Std5”；將無(wú)模板對(duì)照NTC孔的“Task”一欄設(shè)置為“NTC”；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測(cè)樣本TS孔、樣本加標(biāo)回收ERC孔的“Task”一欄設(shè)置為“Unknown”，并且在相應(yīng)的“Sample Name”一欄中分別命名為“NCS”，“TS”，“ERC”；之后點(diǎn)擊“Run Method”設(shè)置擴(kuò)增程序（程序設(shè)置如4.所示），程序設(shè)置好后點(diǎn)擊“Start Run”，開(kāi)始儀器運(yùn)行。
4. 擴(kuò)增程序設(shè)置：設(shè)置反應(yīng)體積30 μL。
|
循環(huán)步驟 |
溫度(℃) |
時(shí)間 |
循環(huán)數(shù) |
|
預(yù)變性 |
95℃ |
5 min |
1 |
|
變性 |
95℃ |
15 sec |
40 |
|
退火/延伸（收集熒光） |
60℃ |
30 sec |
七、qPCR結(jié)果分析
1.在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)給出“Threshold”，有時(shí)系統(tǒng)給出的“Threshold”離基線(xiàn)太近，導(dǎo)致復(fù)孔之間Ct相差甚遠(yuǎn)，可手動(dòng)調(diào)節(jié)“Threshold”至合適位置，點(diǎn)擊“Analyze”。此時(shí)可在“Multicomponent Plot”初步查看擴(kuò)增曲線(xiàn)的形態(tài)是否正常。
2. 在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的R²、擴(kuò)增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的標(biāo)曲：R²>0.99，擴(kuò)增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)，Slope在-3.6~-3.1。
3. 在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一欄可讀取無(wú)模板對(duì)照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測(cè)樣本TS、樣本加標(biāo)回收ERC的檢測(cè)值，單位為copies/μL，后續(xù)可在檢測(cè)報(bào)告中進(jìn)行單位換算。
4. 結(jié)果分析的參數(shù)設(shè)置需依據(jù)具體的機(jī)型及使用的軟件版本，一般也可由儀器自動(dòng)判讀。
5. 根據(jù)待測(cè)樣本TS和樣本加標(biāo)回收ERC檢測(cè)結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率要求在50%~150%之間。加標(biāo)回收率計(jì)算公式：回收率(%) = {樣本加標(biāo)測(cè)定值(eg.copies/µL)-樣本測(cè)定值(eg.copies/µL)} x洗脫體積(µL) / DNA加入量理論值(eg.copies) x 100%。
6. 陰性質(zhì)控NCS的Ct值應(yīng)大于標(biāo)曲最低濃度Ct的均值。
7. 無(wú)模板對(duì)照NTC的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為Undetermined或Ct值≥35。
HB230217
推薦商品
