E.coli宿主細(xì)胞DNA殘留檢測試劑盒是用于定量分析檢測各種生物制品的中間品、半成品和成品中的E.coli殘留DNA含量的試劑盒。

本試劑盒采用探針法熒光定量PCR原理，可專一快速的檢測E.coli細(xì)胞的殘留DNA，其最低檢測限可以達(dá)到fg水平。該試劑盒可與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)	組分名稱	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
		41308ES50 (50T)	41308ES60 (100T)
41308-A	E.coli qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41308-B	E.coli Primer&Probe Mix	250 μL	500 μL
41308-C	DNA Dilution Buffer	2×1.8 mL	4×1.8 mL
41308-D	E.coli DNA Control (30 ng/μL)	25 μL	50 μL

 

運(yùn)輸和保存方法

1. 所有組分均干冰運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年。且41308-A和41308-B均需避光保存。

2. 收到貨后，請(qǐng)檢查共4個(gè)組分是否齊全，并立即放入對(duì)應(yīng)的保存溫度中儲(chǔ)存。

 

注意事項(xiàng)

1. 使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明書，實(shí)驗(yàn)應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。

2. 每個(gè)組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。

3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

 

適用機(jī)型

包含但不限于以下儀器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5，ABI Step OnePlus；

上海宏石醫(yī)療科技：SLAN-96S。

 

使用方法

一、E.coli DNA定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用試劑盒中提供的DNA稀釋液將DNA定量參考品進(jìn)行梯度稀釋，稀釋濃度依次為300 pg/μL，30 pg/μL，3 pg/μL，300 fg/μL，30 fg/μL。

具體操作如下：

1. 將試劑盒中的E.coli DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2. 取6支潔凈的1.5 mL離心管，分別標(biāo)記為Std0，Std1，Std2，Std3，Std4，Std5。

3. 在標(biāo)記為Std0的1.5 mL離心管中加入90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL E.coli DNA Control (30 ng/μL)，即稀釋為3 ng/μL，振蕩混勻后短暫快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-20℃短期保存（不超過3個(gè)月），使用時(shí)避免反復(fù)凍融。

4. 在Std1，Std2，Std3，Std4，Std5管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer，再進(jìn)行梯度稀釋，稀釋方法如下：

稀釋管	稀釋比例	終濃度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

【注】：

1. 每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，該試劑可測試30 fg/μL-300 pg/μL線性范圍。若需要，可適當(dāng)擴(kuò)大或縮小線性范圍。

2. 為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時(shí)將DNA定量參考品分裝儲(chǔ)存于-20℃。

3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天，若長時(shí)間不用，請(qǐng)放置于-20℃。

4. 為確保模板完全混勻，每個(gè)梯度稀釋時(shí)需輕微震蕩混勻約1 min。

 

二、樣本加標(biāo)回收質(zhì)控ERC的制備

根據(jù)需要設(shè)置ERC中的E.coli DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度（以制備加30 pg E.coli DNA量的ERC為例），具體操作如下：

1. 取100 μL待測樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL Std3，混勻，標(biāo)記為ERC。

2. 加標(biāo)回收ERC和同批待測樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備加標(biāo)回收ERC純化液。

 

三、陰性抽提質(zhì)控NCS的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性抽提質(zhì)控NCS，具體操作如下：

1. 取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標(biāo)記為NCS。

2. 陰性質(zhì)控NCS和同批待測樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。

 

四、無模板對(duì)照NTC的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置無模板對(duì)照NTC，具體操作如下：

1. 無模板對(duì)照NTC無需進(jìn)行樣本前處理，在qPCR法檢測殘留DNA含量階段開始配置即可。

2. 每管或孔中的NTC樣本為20 μL Mix混合液（即15 μL E.coli qPCR Mix + 5μL E.coli Primer&Probe Mix）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個(gè)重復(fù)孔的量。

 

五、反應(yīng)體系

組分	體積（μL）
E.coli qPCR Mix	15
E.coli Primer&Probe Mix	5
DNA template	10
總體積	30

【注】：

1.根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液=（反應(yīng)孔數(shù)+2）× (15+5) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。

2. 反應(yīng)孔數(shù)=（5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線+1個(gè)無模板對(duì)照NTC+1個(gè)陰性抽提質(zhì)控NCS+待測樣TS個(gè)數(shù)+待測樣本對(duì)應(yīng)加標(biāo)回收ERC個(gè)數(shù)）× 3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：樣本基質(zhì)溶液或DNA Dilution Buffer進(jìn)行樣本前處理后，所得純化液為NCS

TS (Test Sample)：待測樣本

ERC (Extraction Recovery Control)：待測樣本中加入如30 pg標(biāo)準(zhǔn)品DNA后進(jìn)行樣本前處理，所得純化液為加標(biāo)回收ERC

3. 加樣完成密封好管子后，請(qǐng)低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應(yīng)液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下圖為參考板位：

該示例是對(duì)E.coli殘留DNA qPCR法檢測操作的展示，檢測樣本包括：5個(gè)濃度梯度的E.coli DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線、1個(gè)無模板對(duì)照NTC、1個(gè)陰性質(zhì)控NCS、3個(gè)待測樣本TS、3個(gè)樣本加標(biāo)回收ERC。建議每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。

 

六、擴(kuò)增程序參數(shù)設(shè)置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

1.創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對(duì)定量檢測模板。

2.創(chuàng)建1個(gè)檢測探針，命名為“E.coli-DNA”，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“FAM”，猝滅熒光基團(tuán)為“none”，參比熒光為“ROX”

（參比熒光可根據(jù)儀器型號(hào)等情況，選擇是否需要添加）。

3.在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的“Task”一欄設(shè)置為“Standard”，并且在“Quantity”一欄分別賦值為“300000”，“30000”，“3000”，“300”，“30”（含義為每孔的DNA濃度，單位為fg/μL），并且在相應(yīng)的“sample name”一欄中命名為“300 pg/μL”，“30 pg/μL”，“3 pg/μL”，“300 fg/μL”，“30 fg/μL”；將無模板對(duì)照NTC孔的“Task”一欄設(shè)置為“NTC”；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測樣本TS孔、樣本加標(biāo)回收ERC孔的“Task”一欄設(shè)置為“Unknown”，并且在相應(yīng)的“Sample Name”一欄中分別命名為“NCS”，“TS”，“ERC”；之后點(diǎn)擊“Start Run”，開始儀器運(yùn)行。

4. 擴(kuò)增程序設(shè)置：設(shè)置反應(yīng)體積30 μL。

循環(huán)步驟	溫度（℃）	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	10 min	1
變性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集熒光）	60℃	30 sec

 

七、qPCR 結(jié)果分析

1.在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)給出“Threshold”，有時(shí)系統(tǒng)給出的“Threshold”離基線太近，導(dǎo)致復(fù)孔之間Ct相差甚遠(yuǎn)，可手動(dòng)調(diào)節(jié)“Threshold”至合適位置，點(diǎn)擊“Analyze”。此時(shí)可在“Multicomponent Plot”初步查看擴(kuò)增曲線的形態(tài)是否正常。

2. 在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²、擴(kuò)增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的標(biāo)曲：R²>0.99，擴(kuò)增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)，Slope在-3.6~-3.1。

3. 在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一欄可讀取無模板對(duì)照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測樣本TS、樣本加標(biāo)回收ERC的檢測值，單位為fg/μL，后續(xù)可在檢測報(bào)告中將單位換算成pg/μL或pg/mL。

4. 結(jié)果分析的參數(shù)設(shè)置需依據(jù)具體的機(jī)型及使用的軟件版本，一般也可由儀器自動(dòng)判讀。

5. 根據(jù)待測樣本TS和樣本加標(biāo)回收ERC的檢測結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率要求在50%~150%之間。加標(biāo)回收率計(jì)算公式：回收率(%) = {樣本加標(biāo)測定值(eg.pg/µL)-樣本測定值(eg.pg/µL)} x洗脫體積(µL) / DNA加入量理論值(eg.pg) x 100%。

6. 陰性質(zhì)控NCS的Ct值應(yīng)大于標(biāo)曲最低濃度Ct的均值。

7. 無模板對(duì)照NTC的檢測結(jié)果應(yīng)為Undetermined或Ct值≥35。

 

HB221130