rProtein L免疫沉淀磁珠是粒徑為200 nm的納米磁珠表面上共價偶聯(lián)了大量的 Protein L蛋白，納米級磁珠提供的超大比表面積，具有更多的結(jié)合位點(diǎn)，磁珠使用量更少，非特異性吸附率低。重組 Protein L蛋白是一種免疫球蛋白結(jié)合蛋白，可在不影響抗原結(jié)合的情況下與免疫球蛋白K輕鏈結(jié)合。相對于Protein A和Protein G等其它抗體結(jié)合蛋白，Protein L具有更廣的Ig和Ig亞型結(jié)合范圍。本品適用的范圍廣泛，可應(yīng)用于細(xì)胞裂解液、細(xì)胞分泌液上清、血清、動物腹水以及其它的免疫抗原等樣本的免疫沉淀（IP)和免疫共沉淀(COIP)。

 

產(chǎn)品性質(zhì)

基質(zhì)（Matrix spherical）	硅基磁珠
配體（Ligand）	重組Protein L
結(jié)合能力（Binding Capacity）	＞0.5 mg hIgG /mL磁珠
粒徑 （Particle size）	200 nm
磁珠濃度（Concentration）	10 mg/mL
應(yīng)用（Application）	IP、COIP、CHIP、RIP等

 

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。2-8℃長期儲存，有效期2年。

 

注意事項(xiàng)

1.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2.本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

使用方法

1. 緩沖液配制

平衡/結(jié)合/洗雜液:	0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0
中和緩沖液：	1 M Tris-HCl，pH 8.5
洗脫緩沖液：	0.1 M 甘氨酸，pH 3.0
終止液：	50 mM Tris, pH 7.5

注：上述緩沖液為推薦的緩沖液配制，但IP實(shí)驗(yàn)中不同類型的抗體與抗原結(jié)合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結(jié)合還會受到IP Lysis/Wash Buffer 的影響，因此可自行優(yōu)化操作細(xì)節(jié)或者篩選及配制緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2. 抗原樣品制備

本操作說明書提供以下四種樣品處理方法，建議您根據(jù)不同來源的抗原樣品選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行預(yù)處理，使待檢測抗原釋放至樣品溶液中。

血清樣品處理：若目標(biāo)蛋白豐度較高， 建議用結(jié)合緩沖液稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為10-100 µg/mL，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。

懸浮細(xì)胞樣品處理：離心收集細(xì)胞（4℃, 500g, 10 min），棄上清后稱重，按每毫克細(xì)胞50 µL的比例用1×PBS洗滌2次；按每毫克細(xì)胞5-10 µL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑，混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

貼壁細(xì)胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，按每 1.0×10⁵個細(xì)胞150 µL的比例用1×PBS洗滌兩次；用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞，收集至1.5 mL EP管內(nèi)，按每 1.0×10⁵個細(xì)胞20-30 µL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑，混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

大腸桿菌樣品處理： 離心收集大腸桿菌（4℃, 12000g, 2 min）， 棄上清后稱重， 按每克（濕重）菌體10 mL的比例用1×PBS洗滌2次；按每克（濕重）菌體5-10 mL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑，重懸菌體，超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清（4℃, 17000g, 10 min）。

3.免疫復(fù)合物的制備：

注意：樣品所需的量和孵育時間均依賴于每個特定的抗體-抗原體系，因而可能需要優(yōu)化才能得到最大產(chǎn)量。

以下實(shí)驗(yàn)方案針對 2~10 μg 親和純化的抗體，根據(jù)需 要可以按比例放大。

1）在離心管中，將每個樣品的細(xì)胞裂解液與 2~10 μg 免疫沉淀抗體結(jié)合。每個免疫沉淀反應(yīng)推薦的總蛋白量為500 ~1500 μg。

2）用IP Lysis/Wash Buffer將抗體以及制備好的樣品稀釋至 300~500 μL。

3）在室溫下孵育 1~2 h，或 4℃ 2~4 h，以形成免疫復(fù)合物。

4. 磁珠預(yù)處理：將磁珠漩渦振蕩1 min，使其充分混懸；取25-50 µL磁珠懸液置于1.5 mL EP管中。加入500 µL預(yù)冷結(jié)合緩沖液洗滌，進(jìn)行磁性分離，吸棄上清，重復(fù)1次。加入200 µL結(jié)合緩沖液重懸磁珠備用。

5. 免疫沉淀 

1) 將抗原樣品/抗體混合物加入裝有磁珠的離心管中，保持混勻室溫下孵育1~2 h，或4℃ 2~4 h。

2) 上述磁珠-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，收集上清液，以備后續(xù)檢測。

3) 向離心管中加入1 mL洗雜液，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行磁性分離，棄上清液；從磁分離器上取下離心管，再重復(fù)洗滌兩次。

6．抗原洗脫

A. 變性洗脫 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測。

1) 從磁分離器上取下離心管，向其中加入25 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻， 95℃加熱5 min。

2) 置于磁性分離器上，進(jìn)行磁性分離，收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

B. 非變性洗脫

1) 向磁珠-抗體-抗原復(fù)合物中加入50 μL洗脫液，混合均勻，室溫孵育5 min。

2) 置于磁性分離器上，進(jìn)行磁性分離，收集洗脫液至新的 EP 管中。

3) 重復(fù)步驟 1）和2），收集洗脫液，與2）中洗脫液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

                                                                        HB230106