rProtein G免疫沉淀磁珠是粒徑為 200nm 的納米磁珠表面上共價偶聯(lián)了大量的 Protein G 蛋白，納米級磁珠提供的超大比表面積，具有更多的結合位點，磁珠使用量更少，非特異性吸附率低。重組 Protein G 蛋白更適合于結合mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, rabbit and goat polyclonal Abs, 以及human IgG1, IgG2, IgG3 和 IgG4。本品適用的范圍廣泛，可應用于細胞裂解液、細胞分泌液上清、血清、動物腹水以及其它的免疫抗原等樣本的免疫沉淀（IP)和免疫共沉淀(COIP)。

 

產(chǎn)品性質

基質（Matrix spherical）	硅基磁珠
配體（Ligand）	重組Protein G
結合能力（Binding Capacity）	＞0.85 mg hIgG /mL磁珠
粒徑 （Particle size）	200 nm
磁珠濃度（Concentration）	10 mg/mL
應用（Application）	IP、COIP、CHIP、RIP等

 

運輸和保存方法

冰袋運輸。2-8℃長期儲存，有效期2年。

 

注意事項

1.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2.本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

使用方法

1. 緩沖液配制

平衡/結合/洗雜液:	0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0
中和緩沖液：	1 M Tris-HCl，pH 8.5
洗脫緩沖液：	0.1 M 甘氨酸，pH 3.0
終止液：	50 mM Tris, pH 7.5

注：上述緩沖液為推薦的緩沖液配制，但IP實驗中不同類型的抗體與抗原結合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結合還會受到IP Lysis/Wash Buffer 的影響，因此可自行優(yōu)化操作細節(jié)或者篩選及配制緩沖液進行實驗。

2. 抗原樣品制備

本操作說明書提供以下四種樣品處理方法，建議您根據(jù)不同來源的抗原樣品選擇適當?shù)姆绞竭M行預處理，使待檢測抗原釋放至樣品溶液中。

血清樣品處理：若目標蛋白豐度較高， 建議用結合緩沖液稀釋血清樣品至目標蛋白終濃度為10-100 µg/mL，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。

懸浮細胞樣品處理：離心收集細胞（4℃, 500g, 10 min），棄上清后稱重，按每毫克細胞50 µL的比例用1×PBS洗滌2次；按每毫克細胞5-10 µL的比例加入結合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑，混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

貼壁細胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，按每 1.0×10⁵個細胞150 µL的比例用1×PBS洗滌兩次；用細胞刮棒刮脫細胞，收集至1.5 mL EP管內(nèi)，按每 1.0×10⁵個細胞20-30 µL的比例加入結合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑，混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

大腸桿菌樣品處理： 離心收集大腸桿菌（4℃, 12000g, 2 min）， 棄上清后稱重， 按每克（濕重）菌體10 mL的比例用1×PBS洗滌2次；按每克（濕重）菌體5-10 mL的比例加入結合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑，重懸菌體，超聲裂解細胞，離心收集上清（4℃, 17000g, 10 min）。

3.免疫復合物的制備：

注意：樣品所需的量和孵育時間均依賴于每個特定的抗體-抗原體系，因而可能需要優(yōu)化才能得到最大產(chǎn)量。

以下實驗方案針對 2~10 μg 親和純化的抗體，根據(jù)需 要可以按比例放大。

1）在離心管中，將每個樣品的細胞裂解液與 2~10 μg 免疫沉淀抗體結合。每個免疫沉淀反應推薦的總蛋白量為500 ~1500 μg。

2）用IP Lysis/Wash Buffer將抗體以及制備好的樣品稀釋至 300~500 μL。

3）在室溫下孵育 1~2 h，或 4℃ 2~4 h，以形成免疫復合物。

4. 磁珠預處理：將磁珠漩渦振蕩1 min，使其充分混懸；取25-50 µL磁珠懸液置于1.5 mL EP管中。加入500 µL預冷結合緩沖液洗滌，進行磁性分離，吸棄上清，重復1次。加入200 µL結合緩沖液重懸磁珠備用。

5. 免疫沉淀 

1) 將抗原樣品/抗體混合物加入裝有磁珠的離心管中，保持混勻室溫下孵育1~2 h，或4℃ 2~4 h。

2) 上述磁珠-抗體-抗原復合物進行磁性分離，收集上清液，以備后續(xù)檢測。

3) 向離心管中加入1 mL洗雜液，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復合物均勻分散，然后進行磁性分離，棄上清液；從磁分離器上取下離心管，再重復洗滌兩次。

6．抗原洗脫

A. 變性洗脫 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測。

1) 從磁分離器上取下離心管，向其中加入25 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻， 95℃加熱5 min。

2) 置于磁性分離器上，進行磁性分離，收集上清液進行SDS-PAGE檢測。

B. 非變性洗脫

1) 向磁珠-抗體-抗原復合物中加入50 μL洗脫液，混合均勻，室溫孵育5 min。

2) 置于磁性分離器上，進行磁性分離，收集洗脫液至新的 EP 管中。

3) 重復步驟 1）和2），收集洗脫液，與2）中洗脫液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

                                                                    HB230106