rProtein A/G MagBeads (IP Grade) 蛋白A/G免疫磁珠
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產(chǎn)品說(shuō)明書
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已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
rProtein A/G免疫沉淀磁珠使用“納米表面生物技術(shù)”(S-TEC)，將rProtein A/G高密度定向包被到粒徑為200 nm的納米磁珠表面，納米級(jí)磁珠提供的超大比表面積，具有更多的結(jié)合位點(diǎn)、更高的抗體結(jié)合能力和極低的蛋白非特異性吸附率，一步純化即可從血清樣品中分離出純度>90%的抗體，使用簡(jiǎn)便有效。
天然蛋白A（Protein A）是一種發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一種分離自G型或C型鏈球菌屬的細(xì)胞表面蛋白，二者功能相似，主要通過(guò)與免疫球蛋白（Ig）的Fc區(qū)相互作用，可結(jié)合大多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG，但在兩者結(jié)合特異性上有所不同。rProtein A/G免疫磁珠同時(shí)共價(jià)偶聯(lián)了蛋白A和蛋白G，比單獨(dú)的蛋白A或者蛋白G都有更廣的結(jié)合范圍，實(shí)用性更高。同時(shí)，本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G，不僅維持其本身的Ig親和特性，同時(shí)也去除了天然蛋白本身的非主要結(jié)合域以降低非特異性結(jié)合。本品適用的范圍廣泛，可應(yīng)用于細(xì)胞裂解液、細(xì)胞分泌液上清、血清、動(dòng)物腹水以及其它的免疫抗原等樣本。
另外我司亦提供rProtein A/G IP/Co-IP Kit 蛋白A/G免疫（共）沉淀試劑盒（Cat#36421ES）, 包含足夠完成40個(gè)反應(yīng)的試劑，每個(gè)反應(yīng)使用25 uL磁珠，同時(shí)可進(jìn)行10個(gè)陰性對(duì)照。
翌圣為您提供蛋白純化實(shí)驗(yàn)整體解決方案，相關(guān)產(chǎn)品選購(gòu)請(qǐng)參考：蛋白純化系列產(chǎn)品-選購(gòu)指南
產(chǎn)品性質(zhì)
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基質(zhì)（Matrix spherical） |
硅基磁珠 |
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配體（Ligand） |
重組蛋白A/G |
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結(jié)合能力（Binding Capacity） |
≥0.7 mg hIgG /mL磁珠 |
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粒徑（Particle size） |
200 nm |
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磁珠濃度（Concentration） |
10 mg/mL |
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應(yīng)用（Application） |
IP、COIP、CHIP、RIP等 |
儲(chǔ)存條件
2~8℃保存，有效期2年。
使用說(shuō)明
工作液濃度應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳實(shí)驗(yàn)濃度。
- 緩沖液配制
【注】建議以下緩沖液在使用前用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜過(guò)濾。
裂解緩沖液：0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, pH7.4或WB/IP裂解液（Cat#20118ES）
平衡/結(jié)合/洗雜緩沖液：0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH7.0
交聯(lián)緩沖液：0.2 M 三乙醇胺，pH8.2
中和緩沖液：1 M Tris-HCl，pH 8.5
洗脫緩沖液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0
交聯(lián)劑：DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)
終止液：50 mM Tris-HCl，pH 7.5
- 抗原樣品制備
本操作說(shuō)明書提供以下四種樣品處理方法，建議您根據(jù)不同來(lái)源的抗原樣品選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行預(yù)處理，使待檢測(cè)抗原釋放至樣品溶液中。
血清樣品處理：若目標(biāo)蛋白豐度較高， 建議用結(jié)合緩沖液稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為10-100 µg/mL，置于冰上備用(或置于-20℃長(zhǎng)期保存)。
懸浮細(xì)胞樣品處理：離心收集細(xì)胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM）。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長(zhǎng)期保存）。
貼壁細(xì)胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞兩遍；用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞，收集至1.5mL EP管內(nèi)，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM）。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸?；靹蚝笾糜诒咸幚?/font>10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長(zhǎng)期保存）。
大腸桿菌樣品處理： 離心收集大腸桿菌（4℃, 12000g, 2 min），棄上清后稱重， 按每克（濕重）菌體10 mL的比例用1×PBS洗滌2次；按每克（濕重）菌體5-10 mL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑，重懸菌體，超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清（4℃, 17000g, 10 min）。
- 磁珠預(yù)處理
- 將磁珠漩渦振蕩1 min，使其充分混懸；
- 取50 µL磁珠懸液置于1.5 mL EP管中，放置在磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄保護(hù)液。
- 將EP管從磁分離器上取下來(lái)，加入200 µL結(jié)合緩沖液洗滌，進(jìn)行磁性分離，吸棄上清，重復(fù)洗2次。
4. 抗體吸附
1) 加入目標(biāo)抗體溶液（5-25 µg抗體總量），充分混勻，體積不足500 µL時(shí)用平衡液補(bǔ)足。
2) 室溫孵育 10 min以上（具體時(shí)間根據(jù)結(jié)合效果調(diào)整），可以振蕩或漩渦混合均勻。
3) 將EP 管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清液。如需要可留做進(jìn)一步檢測(cè)。
4) 加入500 μL 洗雜液混合均勻，置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清液。重復(fù)洗雜至少 3次。
5. 抗體交聯(lián) (備選)
1）如果需要將抗體和目標(biāo)抗原復(fù)合物共同洗脫，請(qǐng)忽略本步驟，直接進(jìn)行操作6。 50μL-1mL 磁珠量均可以按照以下步驟操作，無(wú)需額外增加交聯(lián)液體積。
2）加入 1 mL交聯(lián)液，振蕩懸浮，置于磁分離器上，大約1 min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。該操作重復(fù)兩次。
3）再加入1 mL含有20 mM DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride）的交聯(lián)液， 此試劑需要現(xiàn)用現(xiàn)配。振蕩懸浮，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管， 促使溶液和磁珠充分接觸，約30 min后，置于磁分離器上，大約 1 min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。
4）使用1 mL終止液懸浮磁珠，終止交聯(lián)反應(yīng)，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，促使溶液和磁珠充分接觸，約15 min后，置于磁分離器上，大約 1 min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。
5）加入1 mL平衡液，顛倒混勻，置于磁分離器上，大約 1 min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。再重復(fù)兩次。
6. 抗原結(jié)合反應(yīng)
1) 加入含有抗原的樣品（通常100-1000 μL)，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散。
2) 在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管 10 min，使抗原與抗體充分結(jié)合，如結(jié)合力較弱則可在室溫下反應(yīng)1h或者在4℃下反應(yīng)過(guò)夜。
3) 上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，收集上清液，以備后續(xù)檢測(cè)。
4) 向離心管中加入1 mL洗雜液，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行磁性分離，棄上清液；從磁分離器上取下離心管，再重復(fù)洗滌兩次。
7．抗原洗脫
A. 變性洗脫 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測(cè)。
1) 從磁分離器上取下離心管，向其中加入80-100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻， 95℃加熱 10 min。
2) 置于磁性分離器上，進(jìn)行磁性分離，或者離心，收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。
B. 非變性洗脫
1) 向磁珠-抗體-抗原復(fù)合物中加入300 μL洗脫液，混合均勻，室溫孵育10 min。
2) 置于磁性分離器上，進(jìn)行磁性分離，收集洗脫液至新的 EP 管中。
3) 重復(fù)步驟 1）和2），收集洗脫液，與2）中洗脫液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20240730
