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Hieff^? qPCR SYBR Green Master Mix(Rox Provided Seperately)

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產(chǎn)品說明書

FAQ

COA

已發(fā)表文獻(xiàn)

產(chǎn)品描述

Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix是2×實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的預(yù)混合溶液。Mix中含有熱啟動(dòng)Hieff^® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用時(shí)，僅需在擴(kuò)增體系中加入模板和引物即可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，大大簡化操作過程，降低污染幾率。本產(chǎn)品針對(duì)不同型號(hào)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，分別提供不同濃度的 Rox 參比液（High Rox/Low Rox），用于校正孔與孔之間的熒光信號(hào)誤差。

本品采用的DNA聚合酶配體可以隨溫度變化實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特異性PCR擴(kuò)增的因子和提升PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率的因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的線性關(guān)系。

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)	組分名稱	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
組分編號(hào)	組分名稱	11204ES03 （1 mL）	11204ES08 （5×1 mL）	11204ES50 （50×1 mL）	11204ES60 （100×1 mL）
11204-A	Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix	1 mL	5 ×1 mL	50 ×1 mL	100 ×1 mL
11204-B	50×Low Rox	40 μL	200 μL	4 ×500 μL	8 ×500 μL
11204-C	50×High Rox	40 μL	200 μL	4 ×500 μL	8 ×500 μL

運(yùn)輸與保存方式

冰袋運(yùn)輸。-20℃避光儲(chǔ)存，有效期18個(gè)月。

本品避免反復(fù)凍融。產(chǎn)品中含有熒光染料SYBR® Green I，保存或配制反應(yīng)體系時(shí)需避免強(qiáng)光照射。

注意事項(xiàng)

1. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號(hào)：11123ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。

2. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

3. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

反應(yīng)體系（推薦冰上配制）

組分	體積（μL）	體積（μL）	終濃度
Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix	25	10	1×
Forward Primer (10 μM)	1	0.4	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)	1	0.4	0.2 μM
50×High or Low Rox	1	0.4	1×
模板DNA	X	X	-
無菌超純水	to 50	to 20	-

【注】：使用前務(wù)必充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。

a) 參比染料：Rox的添加，可根據(jù)不同儀器型號(hào)進(jìn)行選擇，具體可參考【適用機(jī)型】。

b) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進(jìn)行調(diào)整。

c) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過qPCR反應(yīng)總體積的1/10。

d) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴(kuò)增得到的CT值在20-30個(gè)循環(huán)為好。

e) 反應(yīng)體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性。

f) 體系配制：請于超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應(yīng)管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。

擴(kuò)增程序

三步法程序兩步法程序

循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)		循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	5 min	1		預(yù)變性	95℃	5 min	1
變性	95℃	10 sec	40		變性	95℃	10 sec
退火	55-60℃	20 sec			退火、延伸	60℃	30 sec★	40
延伸	72℃	20 sec★
熔解曲線	儀器默認(rèn)設(shè)置		1		熔解曲線	儀器默認(rèn)設(shè)置		1

【注】：高特異性可選擇兩步法，高效率擴(kuò)增可選擇三步法。

a) 預(yù)變性時(shí)間：根據(jù)不同模板和引物的具體情況可適當(dāng)縮短至2 min。

b) 退火溫度和時(shí)間：請根據(jù)引物和目的基因的長度進(jìn)行調(diào)整。

c) 熒光信號(hào)采集（★）：請參考儀器說明書設(shè)置。

d) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序。

結(jié)果分析

定量實(shí)驗(yàn)至少需要三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后需要確認(rèn)擴(kuò)增曲線及熔解曲線。

1) 擴(kuò)增曲線：標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線為S型。

Ct值落在20-30之間時(shí)，定量分析最準(zhǔn)確；

Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；

Ct值介于30-35之間時(shí)，需要提高模板濃度，或者增大反應(yīng)體系的體積，以提高擴(kuò)增效率，保證結(jié)果分析的準(zhǔn)確性；

Ct值大于35時(shí)，檢測結(jié)果無法定量分析基因的表達(dá)量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲線：

熔解曲線單峰，表明反應(yīng)特異性好可以進(jìn)行定量結(jié)果分析；若熔解曲線出現(xiàn)雙峰或者多峰，則不能進(jìn)行定量分析。

熔解曲線出現(xiàn)雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標(biāo)峰是引物二聚體還是非特異性擴(kuò)增。

如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設(shè)計(jì)擴(kuò)增效率高的引物。

如果是非特異性擴(kuò)增，請?zhí)岣咄嘶饻囟龋蛘咧匦略O(shè)計(jì)更高特異性的引物。

引物設(shè)計(jì)指南

1）推薦引物長度25 bp左右。擴(kuò)增產(chǎn)物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內(nèi)選擇。

2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60ºC-65ºC為佳。

3）引物堿基分布要均勻，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個(gè)相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個(gè)堿基最好為G或C。

4）引物內(nèi)部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列。

5）引物特異性需要用NCBI BLAST程序進(jìn)行核對(duì)。避免引物3’端有2個(gè)堿基以上的非特異性互補(bǔ)。

6）設(shè)計(jì)完成的引物需要進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測，只有具備相同擴(kuò)增效率的引物才可用于定量比較分析。

適用機(jī)型

High Rox適用機(jī)型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus;

Low Rox 適用機(jī)型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio6,7,12k Flex; Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;

不需要Rox校正的儀器型號(hào)：

Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96; Thermo Scientific PikoReal Cycler;

Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR.

相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
Hifair^® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit^HOT	11119ES60	100 T
Hifair^® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)	11121ES60	100 T
Hifair^® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)^HOT	11123ES60	100 T
Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox )^HOT	11201ES08	5 mL
Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus)^HOT	11202ES08	5 mL
Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus)^HOT	11203ES08	5 mL

HB220113

Q：模板用量X 是多少？常用的量是多少？

A：a)X 表示模板 DNA 量需要實(shí)驗(yàn)者在首次實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行摸索。首先對(duì)模板DNA 進(jìn)行稀釋（一般推薦 5-10 倍），然后模板量梯度上樣，選擇 CT 值落在 20-30 之間的最佳上樣量。

b）常用的量是逆轉(zhuǎn)錄 500-1000ng 總RNA，稀釋 10 倍取 1μL cDNA 進(jìn)行qPCR 實(shí)驗(yàn)。

Q：qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性？為什么建議Ct 值要大于 15？

A：a)有效性要滿足三個(gè)條件：

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線：擴(kuò)增效率范圍:90-110%，對(duì)應(yīng)斜率為-3--3.5。R2＞0.98。 (擴(kuò)增效率=10-1/斜率-1)，當(dāng)斜率=-3.32 時(shí)，擴(kuò)增效率=100%。

（2）擴(kuò)增曲線：S 型曲線，且 Ct 值在 15－35 之間，陰性對(duì)照 Ct＞35 或無Ct 值。

（3）熔解曲線：為單一峰。

b)3-15 個(gè)循環(huán)的熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的 10 倍是熒光閾值，Ct 值太小了會(huì)影響曲線。

Q：Rox 的作用？

A：ROX 是一種參比染料，其作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR 震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線。

Q：為什么擴(kuò)增曲線不穩(wěn)定（擴(kuò)增曲線平臺(tái)期鋸齒狀）？

A：可能原因：

a）RNA 純度低，體系中存在較多雜質(zhì)；推薦參數(shù)：OD260/OD280=1.8-2.0， OD260/OD230＞2.0。隨著 qPCR 反應(yīng)的進(jìn)行，阻礙反應(yīng)的因素不斷增加，若 RNA 純度低，雜質(zhì)多，會(huì)進(jìn)一步影響儀器平臺(tái)期的算法，導(dǎo)致出現(xiàn)鋸齒狀。

b）儀器長時(shí)間未做校準(zhǔn)。儀器未校準(zhǔn)會(huì)使儀器算法錯(cuò)誤，導(dǎo)致各種異常結(jié)果。

解決方案：

a）先梯度加大模板稀釋倍數(shù)看優(yōu)化效果。若效果仍不好建議新制備高純度RNA 重新實(shí)驗(yàn)。b）定期（一般 1 年）進(jìn)行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。

Q：為什么擴(kuò)增曲線無法達(dá)到平臺(tái)期？

A：可能原因：

a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推薦 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如 Ct＞30），剛進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期幾個(gè)循環(huán)就停止了反應(yīng)，故無法到達(dá)平臺(tái)期。

b）循環(huán)次數(shù)太少（30 cycles）；循環(huán)次數(shù)過少（如 35）導(dǎo)致剛進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期幾個(gè)循環(huán)就停止了反應(yīng)，故無法到達(dá)平臺(tái)期。

c）試劑擴(kuò)增效率低（CT 小，但無法達(dá)到平臺(tái)期，曲線比較“趴”）。

解決方案：

a）提高模板量；參考 Q1 的優(yōu)化方法。

b）提高循環(huán)次數(shù)；推薦循環(huán)數(shù)：一般 40。低豐度基因可設(shè) 45。

c）做標(biāo)準(zhǔn)曲線測定擴(kuò)增效率，若確實(shí)偏低，則換試劑。

d）增加 Mg2+濃度（會(huì)增加非特異擴(kuò)增）

Q：為什么出現(xiàn)雙峰，并且較低峰 Tm 在 80℃之前？

A：較低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚體（一般mRNA 反轉(zhuǎn)錄后定量，產(chǎn)物在 100-150bp 左右，峰對(duì)應(yīng) Tm 值為 80-90℃。若有引物二聚體存在，引物二聚體大小只有幾十bp，峰對(duì)應(yīng) Tm 值在 70-80℃之間。故會(huì)在 80℃以前出現(xiàn)一個(gè)峰， 80℃以后出現(xiàn)一個(gè)峰），模板濃度過低或引物濃度過高。

解決方案：

a）適當(dāng)提高退火溫度； b）提高模板量，降低引物濃度； c）重新設(shè)計(jì)引物。

Q：為什么出現(xiàn)雙峰，雙峰 Tm 都在 80℃以前？

A：雙峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量時(shí)存在引物二聚體。Micro RNA 反轉(zhuǎn)錄后定量，產(chǎn)物在 80-90bp 左右，峰對(duì)應(yīng)Tm 值為 70-80℃，若有引物二聚體存在，引物二聚體大小只有幾十 bp，峰對(duì)應(yīng) Tm 值也在 70-80℃之間。故會(huì)在 80℃ 以前出現(xiàn)雙峰。

優(yōu)化方法：提高退火溫度、降低引物濃度或重新設(shè)計(jì)引物等方式優(yōu)化。

Q：為什么出現(xiàn)雙峰，并且雙峰Tm 都在 80℃以后？

A：可能原因：

a）引物特異性過差導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。

b）交叉污染。

c）gDNA 污染，可通過 NRC 進(jìn)行確認(rèn)。

解決方案：

a）Blast 檢查引物特異性，差則重新設(shè)計(jì)引物。

b）超凈臺(tái)中操作，注意更換 Tip 頭，避免交叉污染。

c）通過 NRC 陰性對(duì)照進(jìn)行確認(rèn)，若有，需重新制備模板。

Q：為什么是單峰，但 Tm 在 80℃之前？

A：可能原因：

擴(kuò)增產(chǎn)物是完全的引物二聚體，可能是未加模板。

注：若 microRNA，則結(jié)果正常（做 microRNA 定量時(shí)存在引物二聚體。micro RNA 反轉(zhuǎn)錄后定量，產(chǎn)物在 80-90bp 左右，峰對(duì)應(yīng) Tm 值為 70-80℃，若有引物二聚體存在，引物二聚體大小只有幾十bp，峰對(duì)應(yīng) Tm 值也在 70-80℃之間。故會(huì)在 80℃以前出現(xiàn)雙峰）。

解決方案：

進(jìn)行高分辨率瓊脂糖電泳，檢測有無目的條帶，以確定模板是否加入。優(yōu)化方法：新配制無誤的反應(yīng)體系，重新實(shí)驗(yàn)。

Q：為什么是單峰，但峰不尖銳？

A：可能原因：

存在大小相近的非特異性擴(kuò)增

解決方案：a）溫度跨度不高于 7℃，視為可用結(jié)果（即 Tm 值跨度＜7℃可認(rèn)為是同一種產(chǎn)物）；

b）進(jìn)行高濃度瓊脂糖電泳（高分辨率），確認(rèn)是否為單一條帶。

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