產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻
細胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180-200 bp的DNA ladder。
TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 細胞凋亡檢測試劑盒（YSFluorTM 640）可以用來檢測組織細胞在凋亡晚期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因組DNA斷裂時暴露出的3´-羥基（3´-OH）末端摻入YSFluorTM 640-12-dUTP，從而可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。YSFluorTM 640為紅色熒光染料，具有很高的穩(wěn)定性和很強的亮度。
本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。
產(chǎn)品組分
|
編號 |
組分 |
產(chǎn)品編號/規(guī)格 |
||
|
40308ES20（20 T） |
40308ES50（50 T） |
40308ES60（100 T） |
||
|
40308-A |
5×Equilibration Buffer |
750 μL |
1.25 mL×2 |
1.25 mL ×3 |
|
40308-B |
YSFluorTM 640-12-dUTP Labeling Mix |
100 μL |
250 μL |
250 μL×2 |
|
40308-C |
Recombinant TdT Enzyme |
20 μL |
50 μL |
50 μL×2 |
|
40308-D |
Proteinase K(2 mg/mL) |
40 μL |
100 μL |
100 μL×2 |
|
40308-E |
DNase I (1 U/ μL) |
5 μL |
12 μL |
25 μL |
|
40308-F |
10 × DNase I Buffer with MgCl2 |
100 μL |
250 μL |
500 μL |
運輸與保存方法
冰袋（wet ice）運輸。
本試劑盒儲存在-20℃，YSFluorTM 640-12-dUTP Labeling Mix避光儲存于-20℃，保質(zhì)期為1年。
注意事項
1）需自備用于洗滌細胞的PBS，用于封片的抗熒光淬滅封片液，用于固定的4%多聚甲醛。
2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3）本產(chǎn)品僅作科研用途！
操作步驟
一、樣品準備
A. 石蠟包埋組織切片
1）室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5 min，重復(fù)一次，以徹底脫掉石蠟。
2）室溫下用100%乙醇浸泡切片5 min，重復(fù)一次。
3）室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3 min。
4）用PBS浸泡潤洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。
5）按1:100的比例，用PBS稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 μg/mL。
6）每個樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20 min。【注】：Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結(jié)果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間。
7）用PBS溶液潤洗樣本2-3次，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持濕潤。
B. 組織冰凍切片
1）取出冰凍切片，并回溫至室溫。將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，室溫下孵育30 min。
2）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。
3）將玻片浸沒在PBS溶液中，室溫孵育15 min，重復(fù)用PBS清洗1次，共2次。
4）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。
5）按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 μg/mL。
6）每個樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育10 min。【注】：Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結(jié)果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間。
7）于盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次。
【注】：為了避免在清洗步驟中的樣本脫片損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3次進行清洗。
8）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持濕潤。
C. 細胞樣品
【細胞爬片的準備】：在Lab-Tek載波片小室（Chamber Slides）上培養(yǎng)貼壁細胞。在凋亡誘導(dǎo)處理之后，用PBS洗2遍載玻片。
【細胞涂片的制備（以多聚賴氨酸包被的載玻片為例）】
多聚賴氨酸包被的載玻片的準備：吸取50-100 μL 0.01%(w/v)多聚賴氨酸水溶液滴至每一片預(yù)清洗過的玻璃載玻片的表面。在將要用于固定細胞的區(qū)域?qū)⒍嗑圪嚢彼崛芤和可橐槐?。待載玻片晾干之后，迅速用去離子水漂洗，然后讓包被后的載玻片在空氣中晾干30-60 min。包被后的載玻片能在室溫儲存數(shù)月。以約2×107個細胞/mL的濃度將細胞重懸于PBS中，吸取50-100 μL細胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上，用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細胞懸液。
按照以下步驟對細胞樣品進行處理：
1）固定細胞，將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25 min。
2）洗滌載玻片，將其浸入PBS中，室溫放置5 min。重復(fù)用PBS洗一次。
3）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。
4）按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 μg/mL。
5）每個樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育5 min（也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室溫孵育5 min進行通透處理）。【注】：Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結(jié)果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間。
6）PBS潤洗樣本2-3次。輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中。
二、DNA酶處理陽性對照的步驟
在樣本通透處理后，用DNA酶I處理細胞來準備陽性對照載玻片。該流程通常會引起被處理的大多數(shù)細胞顯現(xiàn)熒光。
【注】：DNA酶I處理固定的細胞會引起染色體DNA的斷裂，產(chǎn)生許多可標記的DNA 3’-末端。
1） 按1:10的比例用去離子水稀釋10×DNase I Buffer(每個樣本需用200 µL 1×DNase I Buffer，即需要用20 µL 10×DNase I Buffer和180 µL去離子水混合稀釋)，取其中100 µL滴加到已通透的樣本上，室溫孵育5min。向剩余100 μL 1×DNase I Buffer中加1 μL DNase I (1U/ μL)，使其終濃度為10 U/mL。
2）輕輕叩掉液體，加入100 μL含10U/mL DNase I 的緩沖液，室溫孵育10 min。
3）輕叩載玻片，去掉多余的液體，并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中徹底洗3-4次。
【注】：陽性對照載玻片必須使用單獨的染色缸，否則陽性對照載玻片上殘余的DNase I 可能會在實驗載玻片上引入高背景。
三、標記與檢測
1）按1:5的比例用去離子水稀釋5×Equilibration Buffer（每個樣品需要100 μL 1×Equilibration Buffer）。
2）每個樣本滴加100 μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，室溫孵育10-30 min?；蛘邔⑤d玻片放入一個含1×Equilibration Buffer的缸中，保證緩沖液沒過樣本。在平衡細胞的同時在冰上解凍YSFluorTM 640-12-dUTP Labeling Mix，
并且依照表1，準備足夠量的用于所有實驗的和可選陽性對照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對于面積小于5 cm2的一個標準反應(yīng)，其體積是50 μL，用50 μL乘以實驗和陽性對照反應(yīng)的數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。對于表面積更大的樣本，可成比例的增大試劑體積。
表1.準備用于實驗的和可選陽性對照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液
|
組分 |
體積（ μL/50 μL體系） |
|
ddH2O |
34 |
|
5×Equilibration Buffer |
10 |
|
YSFluorTM 640-12-dUTP Labeling Mix |
5 |
|
Recombinant TdT Enzyme |
1 |
陰性對照體系：準備一份不含TdT酶的對照孵育緩沖液，用ddH2O替代TdT酶。
3）在平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙洗掉100 μL 1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在5cm2面積的細胞上加入50 μL TdT孵育緩沖液。不要讓細胞干掉。這之后的操作，載玻片要避光。
4）把塑料蓋玻片（或封口膜）蓋在細胞上以保證試劑的平均分布，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內(nèi)，在37℃孵育60 min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光。
【注】：塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。
5）移除塑料蓋玻片（或封口膜），并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5 min，換用新鮮PBS重復(fù)2次。
6） 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。【注】：為了降低背景，載玻片在用PBS洗一遍后，可再用含0.1% Triton X-100和5 mg/mL BSA的PBS洗3次，每次5 min，這樣游離的未反應(yīng)的標記物可以清除較干凈。
7）樣本在染色缸中染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液的染色缸，室溫放置5 min。DAPI溶液用PBS新鮮配制并稀釋到2 μg/mL。
8）洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5min。重復(fù)兩次，總共洗三次。
9）擦干載玻片上多余的水并向樣品區(qū)域加100 μL PBS保持樣品濕潤。
10）立即在熒光顯微鏡下分析樣本，在620 nm下檢測YSFluorTM 640紅色熒光，在460 nm觀察藍色的DAPI。DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成藍色，只在凋亡的細胞核中才有YSFluorTM 640-12-dUTP摻入而定位的紅色熒光。如有必要，載玻片能在4℃黑暗條件下存放過夜。
四、利用流式細胞術(shù)檢測懸浮細胞
1）將3-5×106個細胞用PBS洗兩次，每次在4℃，300×g離心10 min，然后重懸在0.5 mL PBS中。
2）固定細胞，加入5 mL 1%配制于PBS中的多聚甲醛溶液，冰上放置20 min。
3）細胞在4℃，300×g離心10 min，去上清并且重懸于5 mLPBS。重復(fù)洗一次，并用0.5 mLPBS重懸細胞。
4）通透細胞，加入5 mL冰上預(yù)冷的70%乙醇，在-20℃孵育4小時。細胞能在70%乙醇中-20℃條件下保存一周，或者，細胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透，室溫放置5 min。
5）細胞在300×g離心10 min，并用5 mL PBS重懸。重復(fù)離心，并于1 mL PBS重懸。
6）轉(zhuǎn)移2×106個細胞至一個1.5 mL的微量離心管。
7）300×g離心10 min，去上清，并用80 μL 1×Equilibration Buffer重懸。室溫孵育5 min。
8）在平衡細胞的同時，在冰上融解YSFluorTM 640-12-dUTP Labeling Mix，并且依照表1，準備足夠量的用于所有反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對于2×106個細胞的一個標準反應(yīng)，其體積是50 μL，用50 μL乘上反應(yīng)數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。
9）細胞在300×g離心10min，去上清并把沉淀重懸在50 μL TdT孵育緩沖液中，37℃孵育60 min，避光。每隔15 min用微量移液器輕輕重懸細胞。
10）加入1 mL 20 mM EDTA終止反應(yīng)，用微量移液器輕柔混勻。
11）300×g離心10 min，去上清并把沉淀重懸在1 mL配制于PBS中的0.1% Triton X-100溶液，其中含5 mg/mL BSA，重復(fù)一次，總共洗2次。
12）用流式細胞儀分析細胞，測量620 nm的YSFluorTM 640紅色熒光。
HB240313
