Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是用FITC標(biāo)記的Annexin V作為探針，來檢測細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生，是細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)中最常用的一種探針組合。
在細(xì)胞凋亡早期階段，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）從胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞外，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中，細(xì)胞膜通透性增加，從而被PS特異的Annexin-V探針標(biāo)記。
Annexin-V為Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有極強(qiáng)的結(jié)合力。PI是一種經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。
將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI被排除在活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性。
圖1. Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測原理
流式細(xì)胞儀分析：
FITC最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長525 nm，FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；
PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。
圖2. Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果
在凋亡實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽性或與預(yù)期結(jié)果不符的情況，可能的原因有補(bǔ)償調(diào)節(jié)不當(dāng)、細(xì)胞濃度過高、消化過度、藥物干擾、藥物處理時(shí)間過長、樣本自身問題等多個(gè)方面，接下來，小翌就帶您一起看看該如何得到一張完美的結(jié)果圖。
補(bǔ)償調(diào)節(jié)不當(dāng)
熒光素被激光激發(fā)后發(fā)出不同波長的熒光，理論上每一種熒光通過選擇恰當(dāng)?shù)臑V光片可被相應(yīng)的檢測器檢測到，而不受其他熒光的干擾。但目前這些熒光染料都具有寬發(fā)射譜性質(zhì)，盡管它們的發(fā)射峰各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊【1】，也就是說，相鄰的檢測器會(huì)檢測到彼此的熒光信號(hào)，這樣就影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，多色分析時(shí)必須進(jìn)行光譜重疊的校正。【2】
圖3. FITC和PI的發(fā)射光譜
調(diào)節(jié)方法：設(shè)置對(duì)照
空白管：誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞不加染料，用來調(diào)節(jié)熒光通道的光電倍增管電壓；
單染管：分別需要只加PI和熒光標(biāo)記的Annexin V兩個(gè)單染管，用來調(diào)節(jié)2個(gè)熒光通道的補(bǔ)償值；
熒光素之間的補(bǔ)償值應(yīng)保持恒定；雙熒光染色時(shí)，如果一個(gè)熒光很強(qiáng)，而另一個(gè)很弱，則一定要做補(bǔ)償；補(bǔ)償只應(yīng)用在同一個(gè)激光激發(fā)的不同熒光素之間，避免補(bǔ)償不足和過度補(bǔ)償。【3】
細(xì)胞濃度過高，培養(yǎng)基消耗過快，導(dǎo)致細(xì)胞饑餓發(fā)生凋亡。因此在做細(xì)胞凋亡處理前，應(yīng)盡量使細(xì)胞處在最佳狀態(tài)，再進(jìn)行細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)處理，避免細(xì)胞本身的衰老引起的凋亡。
圖4. 細(xì)胞濃度過高導(dǎo)致細(xì)胞自發(fā)凋亡，空白對(duì)照（左），實(shí)驗(yàn)組(右)
對(duì)貼壁細(xì)胞，消化是最關(guān)鍵的步驟，消化液需用不含EDTA的胰酶，因?yàn)锳nnexin V和PS的結(jié)合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+ 螯合劑，使用含有EDTA的胰酶會(huì)造成假陰性。細(xì)消化時(shí)可以將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖使胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止，吹打細(xì)胞要輕柔，過度消化和機(jī)械損傷都會(huì)引起細(xì)胞膜的損傷，造成假陽性。
圖5. 細(xì)胞消化過度導(dǎo)致早期凋亡細(xì)胞占89.15%
下圖中可以看出，未經(jīng)處理的空白對(duì)照組（左）早期凋亡占3.38%，晚期凋亡細(xì)胞占6.64%，而右圖中Q1和Q2中的細(xì)胞占90%，幾乎所有細(xì)胞都在PI通道產(chǎn)生熒光，判斷是藥物帶來的熒光干擾。因此，在選擇試劑盒時(shí)，應(yīng)盡量避開藥物和細(xì)胞自帶的熒光信號(hào)。
圖6. 藥物自身的熒光干擾：空白對(duì)照（左）和經(jīng)過藥物處理的細(xì)胞（右）
樣品處理完畢后應(yīng)進(jìn)快進(jìn)行流式檢測。樣品處理時(shí)間過長，也容易導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡和壞死階段，如下圖，空白對(duì)照組結(jié)果正常，但是藥物處理組出現(xiàn)大量凋亡晚期細(xì)胞，考慮是藥物處理時(shí)間過長導(dǎo)致。
圖7. 藥物處理時(shí)間過長：空白對(duì)照（左）和經(jīng)過藥物處理的細(xì)胞（右）
神經(jīng)細(xì)胞膜容易破壞外翻，導(dǎo)致假陽性，所以Annexin V/PI 雙染法流式檢測細(xì)胞凋亡不適用于神經(jīng)細(xì)胞。
如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。
【1】Pietkiewicz S , Schmidt J H , Lavrik I N . Quantification of apoptosis and necroptosis at the single cell level by a combination of Imaging Flow Cytometry with classical Annexin V/propidium iodide staining[J]. Journal of Immunological Methods, 2015, 423:99-103.
【2】陳軍浩, 劉勇, 鄒征云,等. 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI檢測細(xì)胞凋亡陽性界線值及補(bǔ)償值的確定[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2008(04):24-27.
【3】王輝, 高穎. 應(yīng)用流式細(xì)胞儀的常見問題及解決對(duì)策[J]. 現(xiàn)代儀器與醫(yī)療, 2012(01):64-65.
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HB201203
