>>>背景

 

圖1：細(xì)胞凋亡與壞死過程

 細(xì)胞壞死（necrosis）是因病理而產(chǎn)生的被動死亡，如物理性或化學(xué)性的損害因子及缺氧與營養(yǎng)不良等均導(dǎo)致細(xì)胞壞死。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大、胞膜破裂、細(xì)胞內(nèi)容物外溢、核變化較慢、DNA降解不充分和引起嚴(yán)重的局部炎癥反應(yīng)等。       

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡（Apoptosis）一般是指機體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡過程，細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到強烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。細(xì)胞凋亡途徑中各事件的發(fā)生是有時序性的，即各事件按先后順序依次發(fā)生，最終導(dǎo)致凋亡小體的出現(xiàn)，細(xì)胞隨后發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時引起的細(xì)胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義。

 

      細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在正常生長發(fā)育過程中，根據(jù)調(diào)節(jié)機制主動死亡的一種程序性細(xì)胞死亡方式。它是一種高度有序的生物學(xué)過程，包含三個基本階段：信號傳導(dǎo)、執(zhí)行和清除。下面是關(guān)于細(xì)胞凋亡過程的探秘：

1. 信號傳導(dǎo)階段：外源性或內(nèi)源性誘導(dǎo)因子通過受體或細(xì)胞內(nèi)直接作用引起細(xì)胞凋亡信號傳遞，主要包括兩條途徑：內(nèi)部泛素蛋白酶系統(tǒng)和細(xì)胞膜表面信號通路。

2. 執(zhí)行階段：信號傳導(dǎo)引導(dǎo)下，細(xì)胞通過切割蛋白酶家族執(zhí)行程序性死亡，并且有線粒體釋放、半胱氨酸蛋白酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族參與其中。

3. 清除階段：細(xì)胞進(jìn)行程序性死亡時，細(xì)胞壁碎片和細(xì)胞器排出細(xì)胞外，鄰近膠質(zhì)和巨噬細(xì)胞可識別和吞噬部分碎片，但大部分程序性死亡細(xì)胞在死亡前期會形成類別小體，可能會被激活膠質(zhì)和巨噬細(xì)胞吞噬，化解其中的分子或重新使用細(xì)胞組分。

總之，細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境和身體內(nèi)外的調(diào)節(jié)下，細(xì)胞間接或直接通過執(zhí)行和清除階段完成自我死亡。這一過程在生理和病理條件下都具有重要意義。

表一：細(xì)胞凋亡與細(xì)胞死亡的區(qū)別

 

區(qū)別條目	細(xì)胞凋亡	細(xì)胞死亡
起因	生理或是病理性刺激因子誘發(fā)	病理性刺激因子誘發(fā)或是劇烈損傷
作用范圍	單個細(xì)胞	組織或是成群細(xì)胞
細(xì)胞形態(tài)	膜皺縮，體積變小	體積膨大，變性
細(xì)胞膜	保持完整直到形成凋亡小體	破損
細(xì)胞器	無明顯變化	膨大和破損
染色質(zhì)	凝集并在核膜周圍呈現(xiàn)新月形帽狀結(jié)構(gòu)分布	不凝集，呈現(xiàn)絮狀形態(tài)
凋亡小體	有	無
基因組DNA	規(guī)律性降解，呈片段化	隨機降解，呈現(xiàn)彌散型
蛋白質(zhì)合成	有	無
炎癥反應(yīng)	無	有，釋放細(xì)胞內(nèi)含物
分子機制	與蛋白酶caspases基因家族有關(guān)	與蛋白激酶PIP3表達(dá)有關(guān)

 

表二：細(xì)胞凋亡的不同檢測方式

 

早期檢測	PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測	細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測	細(xì)胞色素C的定位檢測	線粒體膜電位變化的檢測
晚期檢測	TUNEL法檢測	LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測)	端粒酶檢測
mRNA水平檢測	Northern雜交檢測	RT-PCR跑膠檢測

 

>>>探秘細(xì)胞凋亡，抓重點、找方法

細(xì)胞處于不同的凋亡階段需要找到不同的特點，配以合適的檢測工具就能準(zhǔn)確解讀細(xì)胞凋亡的密碼。凋亡的細(xì)胞具有不同的生物學(xué)特征，典型的特征包括：1）細(xì)胞膜PS（磷脂酰絲氨酸）外翻；2）線粒體膜電位喪失；3）細(xì)胞核濃縮和斷裂

>>>凋亡早期檢測

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（Phosphotidylserine, PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS由細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。將 Annexin-V 與 PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

 

圖2：Annexin-V 檢測早期凋亡原理示意圖

>>>線粒體膜電位變化的檢測

線粒體膜電位（△Ψm ）的丟失導(dǎo)致線粒體膜中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，細(xì)胞色素C（Cytochrome C）被釋放到細(xì)胞漿中，致使Caspase被激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位（△Ψm ）的理想熒光探針，表現(xiàn)出電勢依賴性的積聚在線粒體內(nèi)。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強烈的紅色熒光；而在凋亡細(xì)胞中，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式。因此顏色的變化將直接反映出線粒體膜電位的變化。

圖3：JC-1檢測熒光與流式結(jié)果示意圖（圖片源自科學(xué)網(wǎng)）

>>>凋亡晚期檢測

細(xì)胞凋亡晚期，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3’-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將熒光素/酶標(biāo)記的dUTP結(jié)合到DNA的3’--OH末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）

 

圖4：TUNEL法檢測原理示意圖

>>>客戶使用數(shù)據(jù)展示

 Annexin-V檢測

 

(a-2, b-2) 100 μg/ml AuNCs@L-GSH 處理24h，(a-3, b-3) 100 μg/ml AuNCs@D-GSH 處理24h，(a-1, b-1) 無處理。

檢測試劑：Cat No. 40302 Annexin-V -FITC/PI檢測流式分析早期凋亡

JC-1檢測

 

上象限中顯示去極化細(xì)胞的百分比；柱狀圖代表正常細(xì)胞，去極化細(xì)胞和壞死細(xì)胞的平均比例

檢測試劑：Cat No. 40705 JC-1檢測線粒體膜電位改變.

Tunel檢測

 

小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L凋亡檢測。第一行代表陰性對照，第二行代表陽性對照

檢測試劑：Cat No. 40306 TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

 

 

石蠟包埋的腫瘤組織（取自裸鼠）

檢測試劑：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)

>>>已使用客戶發(fā)表文章引用

Annexin V

[1]. Zhang C, Li C, Liu Y, et al. Gold Nanoclusters‐Based Nanoprobes for Simultaneous Fluorescence Imaging and Targeted Photodynamic Therapy with Superior Penetration and Retention Behavior in Tumors[J]. Advanced Functional Materials, 2015, 25(8): 1314-1325.IF =13.325

     [2] Zhang L, Wan SS, et al. An Adenosine Triphosphate-Responsive Autocatalytic Fenton Nanoparticle for Tumor Ablation with Self-Supplied H2O2 and Acceleration of Fe(III)/Fe(II) Conversion. Nano Lett. 2018 Nov 7.IF =12.08

[3]. Zhang, C., et al., Insights into the distinguishing stress-induced cytotoxicity of chiral gold nanoclusters and the relationship with GSTP1[J]. Theranostics, 2015. 5(2): p. 134-49.IF =8.537

[4]. Hou, W., et al., pH-Sensitive self-assembling nanoparticles for tumor near-infrared fluorescence imaging and chemo-photodynamic combination therapy[J]. Nanoscale, 2016. 8(1): p. 104-16.IF =7.233

[5].Liu, H., et al., Targeting heat-shock protein 90 with ganetespib for molecularly targeted therapy of gastric cancer[J]. Cell Death Dis, 2015. 6: p. e1595.IF =5.638

[6].Wu, Z., et al., LncRNA-N1LR Enhances Neuroprotection Against Ischemic Stroke Probably by Inhibiting p53 Phosphorylation[J]. Mol Neurobiol, 2016.IF =5.076

[7]. Zhang C, Wang K, Li C, et al. Stress-induced cytotoxicity of chiral Ag nanoclusters[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2(40): 6931-6938.IF =4.776

[8]. Liu X, Liu B, Gao S, et al. Glyco-decorated tobacco mosaic virus as a vector for cisplatin delivery[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2017, 5(11): 2078-2085.IF =4.776

[9].Ni, C., et al., A novel mutation in TRPV3 gene causes atypical familial Olmsted syndrome[J]. Sci Rep, 2016. 6: p. 21815.IF =4.122

[10].Aipire, A., et al., Glycyrrhiza uralensis water extract enhances dendritic cell maturation and antitumor efficacy of HPV dendritic cell-based vaccine[J]. Sci Rep, 2017. 7: p. 43796.IF =4.122

[11].Cui, D., et al., Regression of Gastric Cancer by Systemic Injection of RNA Nanoparticles Carrying both Ligand and siRNA[J]. Sci Rep, 2015. 5: p. 10726.IF =4.122

[12]. Yu, H., et al., Decreased proliferative, migrative and neuro-differentiative potential of postnatal rat enteric neural crest-derived cells during culture in vitro[J]. Exp Cell Res, 2016. 343(2): p. 218-22.IF =3.309

[13]. Li, J., et al., Phenylethanoid Glycosides from Cistanche tubulosa Inhibits the Growth of B16-F10  Cells both in Vitro and in Vivo by Induction of Apoptosis via Mitochondria-dependent Pathway[J]. J Cancer, 2016. 7(13): p. 1877-1887.IF =3.249

[14].Yang, Y., et al., Human CIK Cells Loaded with Au Nanorods as a Theranostic Platform for Targeted Photoacoustic Imaging and Enhanced Immunotherapy and Photothermal Therapy[J]. Nanoscale Res Lett, 2016. 11(1): p. 285.IF =3.125

 

JC-1 or JC-10

 

[1]. Ding M, Ning J, Feng N, et al. Dynamin‐related protein 1‐mediated mitochondrial fission contributes to post‐traumatic cardiac dysfunction in rats and the protective effect of melatonin[J]. Journal of Pineal Research, 2017.IF =11.613

[2]. Bu S, Wang Q, Zhang Q, et al. Human endometrial mesenchymal stem cells exhibit intrinsic anti-tumor properties on human epithelial ovarian cancer cells[J]. Scientific reports, 2016, 6: 37019.IF =4.122

[3]. Wu W B, Menon R, Xu Y Y, et al. Downregulation of peroxiredoxin-3 by hydrophobic bile acid induces mitochondrial dysfunction and cellular senescence in human trophoblasts[J]. Scientific reports, 2016, 6.IF =4.122

[4]. Liu Q, Tao B, Liu G, et al. Thromboxane A2 receptor inhibition suppresses multiple myeloma cell proliferation by inducing p38/c-Jun N-terminal kinase (JNK) mitogen-activated protein kinase (MAPK)-mediated G2/M progression delay and cell apoptosis[J]. Journal of Biological Chemistry, 2016, 291(9): 4779-4792.IF =4.011

[5]. Pan Z, Niu Y, Liang Y, et al. β-Ecdysterone protects SH-SY5Y cells against 6-hydroxydopamine-induced apoptosis via mitochondria-dependent mechanism: Involvement of p38MAPK–p53 signaling pathway[J]. Neurotoxicity research, 2016, 30(3): 453-466.IF =3.186

[6]. Hu T A, Li P, Luo Z, et al. Chloroquine inhibits hepatocellular carcinoma cell growth in vitro and in vivo[J]. Oncology reports, 2016, 35(1): 43-49.IF =2.976

[7].Chen P, Hu T, Liang Y, et al. Synergistic inhibition of autophagy and neddylation pathways as a novel therapeutic approach for targeting liver cancer[J]. Oncotarget, 2015, 6(11): 9002.IF =2.656

 

TUNEL

 

[1]. Zhang C, Li C, Liu Y, et al. Gold Nanoclusters‐Based Nanoprobes for Simultaneous Fluorescence Imaging and Targeted Photodynamic Therapy with Superior Penetration and Retention Behavior in Tumors[J]. Advanced Functional Materials, 2015, 25(8): 1314-1325.IF =13.325

[2].Liu Q, Qian Y, Li P, et al. 131 I-Labeled Copper Sulfide-Loaded Microspheres to Treat Hepatic Tumors via Hepatic Artery Embolization[J]. Theranostics, 2018, 8(3):785-799.IF=8.537

[3]. Zhang C, Wang K, Li C, et al. Stress-induced cytotoxicity of chiral Ag nanoclusters[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2(40): 6931-6938.IF =4.776

[4]. Shi, G., et al., Sox9 facilitates proliferation, differentiation and lipogenesis in primary cultured human sebocytes. J Dermatol Sci, 2017. 85(1): p. 44-50.IF =3.675

[5]. Jiang, Y., et al., Phosphatidic Acid Improves Reprogramming to Pluripotency by Reducing Apoptosis. Stem Cells Dev, 2016. 25(1): p. 43-54.IF =3.315

 

>>>附上小編一些檢測實驗TIPS

AnnexinV/PI檢測

Q：Annexin V/ PI 試劑盒能否檢測除人以外其他動物細(xì)胞凋亡情況？

A：可以。因為Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸（PS）的結(jié)合，而PS不存在種屬間差異。

 

Q：使用Annexin V/ PI 試劑盒進(jìn)行凋亡檢測，用含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞對結(jié)果有影響嗎？

A：會。因為Annexin V 是Ca2+ 依賴的蛋白，EDTA會 螯合Ca2+從而影響Annexin V與PS 的結(jié)合，進(jìn)而影響實驗結(jié)果。

 

Q：如果細(xì)胞自帶GFP蛋白，請問哪種凋亡檢測試劑盒適用該細(xì)胞的凋亡檢測？

A：選用PE標(biāo)記或者APC標(biāo)記的Annexin V凋亡檢測試劑。

 

Q：對于來自血液的細(xì)胞樣品，為什么去除血液中的血小板？

A：因為血小板中含有PS，其能與Annexin V結(jié)合進(jìn)而干擾實驗結(jié)果。

 

Q：Annexin -V 在實驗操作上應(yīng)注意哪些事項？

A：由于Annexin -V染料上帶有熒光基團，在實驗操作上應(yīng)盡量避光操作和孵育；為保證實驗結(jié)果的正確性應(yīng)在染色后1h內(nèi)上機檢測。

TUNEL檢測

Q：組織切片厚度多少比較合適？

A：組織切片過厚，會使得固定效果不理想，最好控制在10μm以內(nèi)。

 

Q：除了多聚甲醛固定，可不可以使用甲醇固定？

A：使用乙醇或甲醇固定會導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。酸性固定液，也容易導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。建議采用新鮮配置的4%中性多聚甲醛固定液。

 

Q：如何避免出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記？

A：（1）對于本身核酶或聚合酶活性水平較高的組織/細(xì)胞，例如平滑肌細(xì)胞，建議取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。

（2）在進(jìn)行末端標(biāo)記的時候，保證細(xì)胞或組織表面保持濕潤，檢測反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。

 

Q：Tunel檢測在實驗操作上有哪些注意事項？

A：熒光基團長期暴露在普通光照下，會發(fā)生嚴(yán)重淬滅，因此在實驗操作上應(yīng)盡量避光操作和孵育。

 

熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)

Q：光補償調(diào)節(jié)的原則？

A: 1）用于調(diào)節(jié)補償?shù)臉颖颈仨殕稳尽?/span>

2）用來調(diào)節(jié)補償?shù)臒晒馑乇仨毰c實驗用的熒光素一樣（例如不能用FITC調(diào)節(jié)EGFP的補償）。

2）橫平豎直：理論上X-Mean或者Y-Mean要相等（如圖所示），但在實際操作中，只需要保證單染的細(xì)胞不跨區(qū)存在。

Q：如何進(jìn)行光補償?shù)恼{(diào)節(jié)？

A：進(jìn)行熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)，需要設(shè)置幾組對照實驗。以AnnxinV-FITC/PI雙染試劑盒為例；

1）空白對照組：不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞，用于電壓的調(diào)節(jié)，調(diào)整前向散射和側(cè)向散射，得到清晰劃分的細(xì)胞群體。

2）凋亡誘導(dǎo)的單染組：陽性對照的細(xì)胞群體需要超過分析的細(xì)胞群體的10%，用于調(diào)節(jié)補償。

3）雙染實驗組：利用空白對照組和單染組調(diào)節(jié)好的參數(shù)進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的獲得。

>>>相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格
Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40302ES20	20 T
Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40302ES50	50 T
Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40302ES60	100 T
Annexin V-EGFP/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40303ES20	20 T
Annexin V-EGFP/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40303ES50	50 T
Annexin V-EGFP/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40303ES60	100 T
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40304ES20	20 T
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40304ES50	50 T
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40304ES60	100 T
Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40305ES20	20 T
Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40305ES50	50 T
Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40305ES60	100 T
Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit	40310ES20	20 T
Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit	40310ES50	50 T
Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit	40310ES60	100 T
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（FITC）	40306ES20	20 T
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（FITC）	40306ES50	50 T
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（FITC）	40306ES60	100 T
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 488）	40307ES20	20 T
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 488）	40307ES50	50 T
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 488）	40307ES60	100 T
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 640）	40308ES20	20 T
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 640）	40308ES50	50 T
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 640）	40308ES60	100 T

 

HB20190605