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      Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒

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      產品說明書

      FAQ

      COA

      已發(fā)表文獻

      產品描述

      Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒是用FITC標記的Annexin V作為探針,來檢測細胞早期凋亡的發(fā)生。

      其檢測原理為:在正常的活細胞中,磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine,PS)位于細胞膜的內側,但在早期凋亡的細胞中,PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ(膜聯蛋白-V)是一種分子量為35-36 kDaCa2+ 依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力結合,可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。

      另外,本試劑盒中還提供了碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI是一種核酸染料,它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜,但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此,將Annexin V與PI聯合使用時,PI 則被排除在活細胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結合染色呈現雙陽性(Annexin V+/PI+)。

      本試劑盒可用于流式細胞儀、熒光顯微鏡進行檢測。

       

      產品組分

      編號

      組分

      產品編號/規(guī)格

      40302ES20(20T)

      40302ES50(50T)

      40302ES60(100T)

      40302-A

      Annexin V-FITC

      100 μL

      250 μL

      500 μL

      40302-B

      PI Staining Solution

      200 μL

      500 μL

      1.0 mL

      40302-C

      1×Binding Buffer

      10 mL

      25 mL

      50 mL

       

      運輸與保存方法

      冰袋(wet ice)運輸。-20℃避光保存,避免反復凍融,一年有效。

      【注】:如果需要在短時間內多次重復使用,可以在4℃避光保存,半年有效。

       

      注意事項

      1)由于細胞凋亡是一個快速的過程,建議樣品在染色后1小時之內進行分析。

      2) 對于貼壁細胞,消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞,需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作,盡量避免人為的損傷。胰酶消化時間過短,細胞需要用力吹打才能脫落,容易造成細胞膜的損傷;PI攝入過多,消化時間過長,細胞膜同樣易造成損傷,甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后,輕搖使胰酶與細胞充分接觸,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余少量胰酶再消化一段時間,待細胞間空隙增大,瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA,EDTA會影響Annexin V與PS的結合。

      3)如果樣品來源于血液,請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS,能與Annexin V結合,從而干擾實驗結果???/span>以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

      4)試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體甩至管底,避免開蓋時液體灑落。

      5Annexin V-FITC和PI是光敏物質,在操作時請注意避光。

      6)本產品僅作科研用途!

       

      操作方法

      1.1 樣品染色

      1)懸浮細胞300 g,4℃離心5 min收集細胞。

      貼壁細胞:用不含EDTA的胰酶消化后,300 g,4℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長,以防引起假陽性。

      2)用預冷的PBS洗滌細胞2次,每次均需300 g,4℃離心5 min。收集1~5×105細胞。

      3)吸棄PBS,加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。

      4)加入5 μL Annexin V-FITC和10 μLPI Staining Solution,輕輕混勻。

      5)避光、室溫反應10-15 min。

      6)加入400 μL 1×Binding Buffer,混勻后放置于冰上,樣品在1小時內用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

      【注】:為了避免洗滌細胞時損失細胞,在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

      1.2 樣品分析

      A.流式細胞儀分析:

      FITC最大激發(fā)波長為488 nm,最大發(fā)射波長525 nm,FITC的綠色熒光在FL1通道檢測;PI-DNA復合物的最大激發(fā)波長為535 nm,最大發(fā)射波長為615 nm,PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析,繪制雙色散點圖(two-color dot plot),FITC為橫坐標,PI為縱坐標。典型的實驗中,細胞可以分成三個亞群,活細胞僅有很低強度的背景熒光,早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光,晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

      B.熒光顯微鏡分析:

      1)滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細胞懸液于載玻片上,并用蓋玻片蓋上細胞。

      【注】:對于貼壁細胞,可直接用蓋玻片培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡。

      2)在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色,PI熒光信號呈紅色。

       

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      HB220609

      400-6111-883