一、染色質(zhì)開放研究技術(shù)發(fā)展史
 

ATAC-seq作為表觀組學(xué)研究技術(shù)之一，已經(jīng)被很多組學(xué)專家所接受并已經(jīng)在應(yīng)用，那關(guān)于ATAC-seq技術(shù)，你了解多少呢？

要介紹ATAC-seq，不得不提到它的發(fā)展史。在染色質(zhì)開放性研究領(lǐng)域，也是走了一段長(zhǎng)長(zhǎng)的路，這也是一條長(zhǎng)江后浪推前浪的路。

DNase-seq：這項(xiàng)技術(shù)屬于開放染色質(zhì)研究的老前輩，它的開發(fā)主要是因?yàn)槿旧|(zhì)區(qū)域有很多DNase I HS位點(diǎn)，DNase-seq依賴于DNaseI核酸酶的消化來識(shí)別核小體耗盡的開放染色質(zhì)區(qū)域，在那里所有類型的因子都有結(jié)合位點(diǎn)，但它不能識(shí)別哪些特定的因子被結(jié)合【1】。

FAIRE-Seq：FAIRE-Seq的技術(shù)開發(fā)，其實(shí)是在經(jīng)典DNA-蛋白互作技術(shù)ChIP-seq的基礎(chǔ)上的技術(shù)衍生及應(yīng)用。2007年，F(xiàn)AIRE-seq技術(shù)正式問世，它傳承了ChIP-seq的甲醛交聯(lián)和超聲打斷，所以整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間周期較長(zhǎng)，也有一定的實(shí)驗(yàn)困難【2-3】。

MNase-Seq也是在ChIP-seq的基礎(chǔ)上進(jìn)行的發(fā)展，MNase酶的應(yīng)用也是在ChIP技術(shù)中替代超聲的步驟時(shí)使用的。MNase-Seq技術(shù)是在應(yīng)用FAIRE-seq時(shí)有理有據(jù)的迭代更新【4】。

ATAC-seq技術(shù)的發(fā)展得益于Tn5轉(zhuǎn)座酶的研究，Tn5轉(zhuǎn)座酶的應(yīng)用，大大簡(jiǎn)化了開放染色質(zhì)研究的時(shí)間，從最初2-3天的實(shí)驗(yàn)周期，縮短到2-3小時(shí)【5】。
 

 

圖：不同染色質(zhì)開放性研究技術(shù)對(duì)比，圖片來源：Lee B. H. et al. 2021
 

Tn5酶的出現(xiàn)，確實(shí)是改變了表觀技術(shù)研究的應(yīng)用，ATAC-seq技術(shù)問世以來，大量的樣本獲得了較好的開放染色質(zhì)區(qū)域的信息，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控更上一層樓。但是，Tn5酶最初的應(yīng)用，不是在開放染色質(zhì)研究，而是在DNA文庫(kù)構(gòu)建時(shí)的酶切片段化，Tn5酶的應(yīng)用，使得超低濃度DNA建庫(kù)成為可能，低至1ng的樣本都能很好的建庫(kù)。
 

 

圖：基于Tn5酶的建庫(kù)流程
 

二、ATAC-seq技術(shù)研究要點(diǎn)？
 

但是在應(yīng)用時(shí)，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)，常規(guī)Tn5建庫(kù)試劑盒，明明是55℃酶切，為什么在進(jìn)行ATAC-seq研究時(shí)，溫度就變成了37℃？能不能也進(jìn)行55℃酶切？實(shí)際情況是37℃和55℃都是可以酶切實(shí)驗(yàn)，只是在55℃時(shí)，有些樣本的開放狀態(tài)可能會(huì)有影響，造成后續(xù)數(shù)據(jù)分析時(shí)背景噪音較高【7】，而37℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，背景噪音普遍較低。當(dāng)然，我們?cè)谡鎸?shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)，也會(huì)發(fā)現(xiàn)有些樣本37℃酶切效果不好時(shí)，也是可以考慮改變酶切溫度。
 

除了以上介紹的內(nèi)容，關(guān)于ATAC-seq，到底是在研究什么？數(shù)據(jù)分析時(shí)，要重點(diǎn)關(guān)注什么呢？

首先我們從ENCODE上公布的ATAC的數(shù)據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來看看關(guān)注點(diǎn)：

1）實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置至少2個(gè)生物學(xué)重復(fù)；對(duì)無法做生物學(xué)重復(fù)的樣本至少2個(gè)技術(shù)重復(fù)

2）每個(gè)實(shí)驗(yàn)組需要有單端測(cè)序時(shí)15 M的clean reads或者雙端測(cè)序50 M clean reads；

3）mapping率應(yīng)最低80%；

4）用IDR值評(píng)判重復(fù)性；

5）NRF>0.9, PBC1>0.9, and PBC2>3評(píng)估文庫(kù)復(fù)雜性；

6）peak數(shù)50000以上；

7）文庫(kù)需呈現(xiàn)核小體pattern，至少需要有核小體free的區(qū)域展現(xiàn)；

8）FRiP值需大于0.2；

9）TSS分布圖來判斷背景信號(hào)。

總的來說，就是在文庫(kù)構(gòu)建之后，需要對(duì)文庫(kù)進(jìn)行庫(kù)檢，文庫(kù)需要符合核小體pattern，即呈現(xiàn)出linker峰、一個(gè)核小體峰、兩個(gè)核小體峰等等，然后測(cè)序量需要達(dá)到要求，另外，測(cè)序后的數(shù)據(jù)分析，peak數(shù)是一個(gè)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，最后就是TSS分布圖來評(píng)估背景。
 

         

拿到ATAC-seq測(cè)序數(shù)據(jù)之后，我們要去關(guān)注什么？ATAC-seq的結(jié)果，通常會(huì)分兩大類，一類是核小體定位，一類是轉(zhuǎn)錄因子。發(fā)展到現(xiàn)在，關(guān)注轉(zhuǎn)錄因子的群體越來越多，通過獲得的peak進(jìn)行motif分析，然后預(yù)測(cè)motif對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子來進(jìn)行后續(xù)的研究。當(dāng)然，基于開放染色質(zhì)區(qū)域通常是基因的啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域，所以將染色質(zhì)開放區(qū)與基于的表達(dá)情況進(jìn)行關(guān)系分析，即ATAC-seq+RNA-seq進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，來找尋關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的關(guān)鍵靶基因。 

當(dāng)然了，ATAC-seq聯(lián)合Hi-C以及組蛋白修飾的數(shù)據(jù)進(jìn)行增強(qiáng)子鑒定，又是另外一個(gè)故事了。

 

翌圣關(guān)聯(lián)產(chǎn)品速遞

產(chǎn)品定位	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品編號(hào)	規(guī)格
ATAC建庫(kù)試劑盒	Hieff NGS® ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina®	12208ES12/48	12/48 T
適合ATAC和CUT&Tag小片段純化磁珠	Hieff NGS ® Smarter DNA Clean Beads (50 bp 以上)	12600ES03/08	1 mL/5 mL
Tn5專用接頭	Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index）	12416ES	96 index

參考文獻(xiàn)：
[1] Boyle A P ,  Davis S ,  Shulha H P , et al. High-Resolution Mapping andCharacterization of Open Chromatin across the Genome[J]. Cell, 2008, 132(2):311-322.

[2] Giresi P G ,  Kim J ,  Mcdaniell R M , et al. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin[J]. Genome Research, 2007, 17(6):877-885.

[3]Jeremy, M, Simon, et al. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.[J]. Nature protocols, 2012.

[4] Pajoro A , JM Muiño,  Angenent G C , et al. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis[J]. Methods in Molecular Biology, 2017.

[5] Buenrostro J D ,  Wu B ,  Chang H Y , et al. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide[J]. Current Protocols in Molecular Biology, 2015, 109(1).

[6] Lee B H ,  Rhie S K . Molecular and computational approaches to map regulatory elements in 3D chromatin structure[J]. Epigenetics & Chromatin, 2021, 14(1).

[7] Zhang H ,  Rice M E ,  JW  Alvin, et al. Extensive evaluation of ATAC-seq protocols for native or formaldehyde-fixed nuclei[J]. BMC Genomics, 2022, 23(1):1-18.