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首頁(yè) / 殘留核酸去除 / 產(chǎn)品應(yīng)用詳情

干貨分享|如何破解生物制品中的核酸殘留難題？

近年來(lái)，生物制品在市場(chǎng)中所占比重越來(lái)越大，與之俱來(lái)的生物安全性問(wèn)題也隨之而來(lái)。我國(guó)參照WHO、FDA和歐盟的標(biāo)準(zhǔn)，在藥典中明確規(guī)定酵母、大腸桿菌表達(dá)的生物制品中的DNA殘留量不超過(guò)10ng/劑，CHO和vero細(xì)胞表達(dá)的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超過(guò)100或10pg/劑^【1】。

生物制品的核酸殘留去除主要集中在病毒疫苗生產(chǎn)、重組蛋白藥物純化、細(xì)胞治療和疫苗研究中緩解PBMC細(xì)胞結(jié)團(tuán)以及慢病毒的大規(guī)模純化等。

翌圣生物UCF.ME^TM核酸酶可降解無(wú)論是單鏈、雙鏈、線性、圓形還是超螺旋形式的DNA及RNA，無(wú)堿基偏好性。UCF.ME^TM核酸酶具有極高的核酸酶活性以及超強(qiáng)的耐受性，可適用于多種操作環(huán)境，短時(shí)間內(nèi)就使樣品中所有的游離核酸降解成長(zhǎng)度為3-5個(gè)堿基的5’末端的寡核苷酸。

超高酶活

超高純度

GMP工藝生產(chǎn)

無(wú)動(dòng)物源性

無(wú)抗生素

耐受性強(qiáng)

翌圣生物UCF.ME^TM核酸酶在10萬(wàn)級(jí)GMP車間生產(chǎn)，單產(chǎn)可以達(dá)到300億U/100L。同時(shí)還配備了自動(dòng)化、無(wú)菌化的分裝系統(tǒng)和嚴(yán)格的質(zhì)控管理體系，完全符合監(jiān)管要求，適用于大批量生物制品生產(chǎn)過(guò)程中的核酸去除。

1、病毒疫苗生產(chǎn)

疫苗的使用者是健康人，并且許多疫苗已用于嬰幼兒。因此，藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)應(yīng)更加注意生物產(chǎn)品的安全性，尤其是殘留DNA和RNA的質(zhì)量控制。現(xiàn)階段病毒疫苗純化主要是采用凝膠滲透色譜法。但是，疫苗中殘留的Vero細(xì)胞DNA經(jīng)常超過(guò)規(guī)定的最低限度。Li Si-Ming等^【2】在2014年發(fā)表的文獻(xiàn)中指出，全能核酸酶能夠有效去除疫苗中殘留的宿主細(xì)胞DNA。經(jīng)過(guò)核酸酶的病毒疫苗，再用離子交換層析的方法進(jìn)行純化，可以將疫苗中的核酸殘留量降到限值以下，并且顯著提高了生產(chǎn)回收率。Komatsu Y^【3】等的研究表明，全能核酸酶處理對(duì)病毒的感染效率無(wú)顯著影響。

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圖1. 點(diǎn)片法檢測(cè)經(jīng)核酸酶處理的疫苗半成品中的核酸殘留

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圖2. 經(jīng)過(guò)核酸酶處理的樣品，殘留量降至100pg/mL以下

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圖3. 核酸酶的處理對(duì)病毒感染效率無(wú)顯著影響

2、重組蛋白藥物殘留核酸去除

在傳統(tǒng)的放化療治療的局限下，重組蛋白藥物逐漸成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。為了臨床治療的需要，重組蛋白產(chǎn)品的使用劑量已從微克增加到毫克或甚至是克，并且大多數(shù)生物制品需要長(zhǎng)期重復(fù)給藥。目前的重組蛋白藥物主要來(lái)源于CHO細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)過(guò)常規(guī)的14天反應(yīng)器fed-batch培養(yǎng)，密度最高可以達(dá)到3×10⁷個(gè)/mL。因此，重組蛋白藥物中的核酸殘留去除極為重要。

3、防止細(xì)胞結(jié)團(tuán)

從全血中分離出的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，在細(xì)胞治療和疫苗研究中有重要應(yīng)用，但是，冷凍PBMC（特別是從儲(chǔ)存的血液中提取的PBMC）解凍時(shí)容易成團(tuán)，阻礙進(jìn)一步分析。2015年，Lin D等^【4】人制定的protocol中明確說(shuō)明，在PBMC解凍緩沖液中加入全能核酸酶，可以有效防止細(xì)胞成團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)PBMC的冷凍保存，該方法被廣泛用于疫苗評(píng)估和CAR-T細(xì)胞療法研究中PBMC細(xì)胞的復(fù)蘇。

4、慢病毒的大規(guī)模純化

慢病毒介導(dǎo)的基因治療和細(xì)胞治療將會(huì)很快成為不僅是罕見(jiàn)遺傳病，也會(huì)是血液腫瘤、HIV等感染性疾病的常規(guī)治療方法?？蓴U(kuò)大的慢病毒生產(chǎn)工藝的改進(jìn)變得越來(lái)越迫切。除了載體的滴度及產(chǎn)量，對(duì)于慢病毒批次更關(guān)心的指標(biāo)主要是各種污染物的去除。

如下圖，在工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域，慢病毒大規(guī)模純化的常用步驟包括：用膜過(guò)濾澄清，隨后用切向流過(guò)濾/超濾或者體積排阻色譜來(lái)濃縮。所有機(jī)構(gòu)的病毒純化流程中都采用了全能核酸酶來(lái)降低細(xì)胞殘留的以及質(zhì)粒來(lái)源的DNA污染。

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圖4. 不同公司/研究所采用的慢病毒大規(guī)模純化步驟中均含有全能核酸酶處理步驟^【5】

為了滿足生產(chǎn)加工和成本要求，翌圣生物提供3種不同應(yīng)用級(jí)別的UCF.ME^TM核酸酶，可同時(shí)滿足科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)需求。

表1. 3種不同級(jí)別UCF.ME^TM核酸酶質(zhì)檢結(jié)果

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注：檢測(cè)并合格（√）；無(wú)檢測(cè)該指標(biāo)（-）；

產(chǎn)品訂購(gòu)

產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
UCF.ME^TM UltraNuclease UCF.ME^TM全能核酸酶	20156ES25	25 KU
	20156ES50	50 KU
	20156ES60	100 KU
UCF.ME^TM UltraNuclease（Endotoxin-free） UCF.ME^TM全能核酸酶（無(wú)內(nèi)毒素）	20125ES25	25 KU
	20125ES50	50 KU
	20125ES60	100 KU
UCF.ME^TM UltraNuclease（GMP Grade）	20157ES25	25 KU
	20157ES50	50 KU
	20157ES60	100 KU

參考文獻(xiàn)

[1]王蘭,王軍志.關(guān)于生物制品殘余DNA質(zhì)量控制問(wèn)題[J].中國(guó)新藥雜志,2011,20(08):678-683+687.

[2] Li Si-Ming, Bai Fu-Liang, Xu Wen-Juan, et al. Removing residual DNA from Vero-cell culture-derived human rabies vaccine by using nuclease. 2014, 42(5):271-6.

[3] Komatsu Y, Kakuya Y, Tomonaga K. Production of high‐titer transmissionヾefective RNA virus‐based episomal vector using tangential flow filtration[J]. Microbiology and Immunology, 2020.

[4] Lin D, Gupta S, Maecker H T. Intracellular Cytokine Staining on PBMCs Using CyTOF? Mass Cytometry[J]. BIO-PROTOCOL, 2015, 5(1).

[5] Merten O W, Hebben M, Bovolenta C. Production of lentiviral vectors[J]. Molecular Therapy Methods & Clinical Development, 2016, 3:16017.

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