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      首頁 / 酶原料 / 產(chǎn)品應(yīng)用詳情
       
      NGS文庫構(gòu)建-關(guān)鍵酶竟然是這些？
       
      

      高通量測序又稱下一代測序技術(shù)(Next-generation Sequencing, NGS)，相對于第一代DNA測序技術(shù)（Sanger法），它可以同時(shí)對幾十萬乃至數(shù)百萬條核酸分子序列進(jìn)行測定，具有通量高、成本低、規(guī)模大等顯著優(yōu)勢，應(yīng)用范圍非常廣泛，目前已經(jīng)成為全球主流測序技術(shù)。
      


       
      


      NGS測序流程主要分為樣本制備、文庫構(gòu)建、上機(jī)測序、數(shù)據(jù)分析四個(gè)流程，在上述涉及的相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程中，酶在其中起著至關(guān)重要的作用，這里針對性的對文庫構(gòu)建中的關(guān)鍵酶進(jìn)行介紹。
      


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      圖1. NGS測序流程圖(Gulilat, M. et al. 2019, BMC Medical Genomics)
      


       
      


      文庫構(gòu)建的本質(zhì)是將片段化后的基因組DNA兩端加上通用接頭序列，通過PCR擴(kuò)增獲取足夠多能夠上機(jī)測序的文庫核酸分子。根據(jù)樣本類型，又分為DNA建庫和RNA建庫。在DNA文庫構(gòu)建過程中，TA克隆連接接頭建庫是目前商業(yè)技術(shù)中最常用的技術(shù)手段，主要建庫流程如下：
      


       
      

      


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      圖2. Illumina 平臺DNA文庫構(gòu)建流程
      


       
      

      


      

      

      

      

      

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      DNA片段化
      

      

      

      

      


      

       
      


      由于目前市場中測序儀的測序長度通常在150-500bp之間，因此需要使用機(jī)械打斷或酶切打斷的方法將大片段基因組DNA片段化為小片段的DNA。機(jī)械打斷的方式對樣本的損耗相對較高，操作方式也更為復(fù)雜，市面上也常用酶切的方式對基因組DNA進(jìn)行打斷。與機(jī)械法相比，酶切法的成本更低，操作更簡便，加入片段化酶后僅需反應(yīng)一段時(shí)間即可。
      


       
      


      目前常用的片段化酶主要有兩種，一種是基于轉(zhuǎn)座子原理的Tn5轉(zhuǎn)座酶，另一種是核酸內(nèi)切酶的混合酶，但是這些片段化酶的效果容易被樣本GC含量、堿基偏好性所影響。與此相比，翌圣研發(fā)的片段化酶(Yeasen Cat#12917)酶切效果穩(wěn)定，偏好性遠(yuǎn)低于Tn5轉(zhuǎn)座酶，針對不同的DNA類型樣本（包括FFPE樣本）都有優(yōu)異的測序結(jié)果。
      


       
      

      


      

      

      

      

      

      “
      

      

      

      


      

      

      末端修復(fù)，3'端加“A”：
      

      

      

      

      


      

       
      


      打斷后的DNA會(huì)產(chǎn)生5'/3'黏性末端以及平末端，而所有的黏性末端都需要轉(zhuǎn)為平末端，包括3'突出末端切平、5'突出末端補(bǔ)平。在使用TA連接的方式進(jìn)行接頭連接時(shí)，DNA片段還需要5'端磷酸化和在3'端加“A”，才能與帶“T”黏性末端的接頭互補(bǔ)配對。以上過程由T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶協(xié)作完成。
      


       
      


      T4 DNA聚合酶(Yeasen Cat#12901)具有5'→3'DNA聚合酶活性，可沿 5'→3'方向催化合成 DNA，補(bǔ)平5'突出末端；同時(shí)該酶也具有3'→5'外切酶活性，能夠用于3'突出末端的切平，從而將含黏性末端的DNA片段轉(zhuǎn)變?yōu)槠侥┒薉NA。
      


       
      


      由于人工合成的PCR引物、接頭等5'端通常都是羥基基團(tuán)而不是磷酸基團(tuán)，因此需要T4多聚核苷酸激酶(Yeasen Cat#12902)在ATP 存在時(shí)催化ATP的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到寡核苷酸鏈的5'端羥基末端上，為下一步連接接頭做準(zhǔn)備。
      


       
      


      Taq DNA聚合酶(Yeasen Cat#13486)具有5'→3'聚合酶活性，可以從5'→3'方向合成DNA，同時(shí)它具有的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性可以在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個(gè)核苷酸“A”。
      


       
      

      


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      圖3. 多種酶參與末端修復(fù)過程
      


       
      

      


      

      

      

      

      

      “
      

      

      

      


      

      

      接頭連接：
      

      

      

      

      


      

       
      


      接頭是文庫中的重要組成部分，測序中常用的Illumina平臺Y型接頭，包含P5/P7、Index、以及Rd1/Rd2 SP序列。其中，P5/P7序列用于和測序芯片上的序列進(jìn)行配對，將待測片段固定在Flowcell上完成橋式擴(kuò)增；Index用來區(qū)分上機(jī)測序混合文庫中的不同樣本，而Rd1/Rd2 SP是Read1和Read2測序引物結(jié)合區(qū)域。接頭連接一般用T4 DNA連接酶(Yeasen Cat#10298)，它可以修復(fù)雙鏈DNA上的單鏈切口，使兩個(gè)相鄰的核苷酸重新連接起來，在接頭連接中可將帶有“T”黏性末端的接頭和帶“A”黏性末端的DNA片段連接起來形成一個(gè)完整的雙鏈。
      


       
      

      


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      圖4. Illumina 平臺一般接頭連接過程
      


       
      

      


      

      

      

      

      

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      PCR富集：
      

      

      

      

      


      

       
      


      通過PCR反應(yīng)獲取到足夠多帶接頭的DNA序列，上機(jī)完成對樣本核酸序列的測序。PCR通常用的Canace 高保真DNA聚合酶(Yeasen Cat#13476)具有5'→3'聚合酶結(jié)活性，可沿 5'→3'方向合成 DNA；除此之外，還具有3'→5'外切酶的活性，能夠在擴(kuò)增過程中糾正錯(cuò)誤摻入的堿基，從而快速、高保真的擴(kuò)增DNA片段。
      


       
      


      RNA文庫的構(gòu)建，根據(jù)RNA的種類可以分為mRNA文庫、LncRNA文庫等，其中常規(guī)RNA文庫構(gòu)建包括以下過程：
      


       
      

      


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      圖5. Illumina平臺mRNA文庫構(gòu)建
      


       
      

      


      

      

      

      

      

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      RNA富集：
      

      

      

      

      


      

      不論真核生物還是原核生物，其RNA中最多的是rRNA，其占比高達(dá)80%。如果直接對樣本的總RNA進(jìn)行測序，測序數(shù)據(jù)中絕大部分將為rRNA的相關(guān)數(shù)據(jù)，因此必須通過RNA富集的方法去除rRNA的干擾。RNA富集的方法有基于oligo-dT富集的mRNA方法和rRNA去除法。
      


       
      


      真核生物mRNA在3'端具有明顯的poly(A)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用Oligo(dT)磁珠可以富集樣本轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA，從而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的分析，適用于高質(zhì)量的RNA樣本。而rRNA去除的方法對樣本質(zhì)量的要求要低于mRNA測序，同時(shí)適用于低質(zhì)量(如FFPE樣本)和高質(zhì)量RNA樣本，也適用于原核生物類型樣本，商業(yè)常用RNase H消化的方法去除rRNA。具體步驟如下：
      

      


      

      

      

      首先，合成能夠與rRNA結(jié)合的特異性寡核苷酸探針；
      


       
      


      其次，使用能夠降解RNA-DNA雜合鏈中RNA 的RNase H(Yeasen Cat#12906)去除和探針結(jié)合的rRNA；
      


       
      


      最后，使用可以消化單鏈或雙鏈的DNA 的DNase I(Yeasen Cat#10325)消化掉DNA探針，從而最終達(dá)到去除rRNA的目的。
      

      

      

      


      

       
      

      


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      圖6. 基于酶法的rRNA去除原理示意圖
      


       
      

      


      

      

      

      

      

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      RNA片段化：
      

      

      

      

      


      

      通常在二價(jià)陽離子以及高溫的作用下，將大片段的RNA打斷為小片段。
      


       
      

      


      

      

      

      

      

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      cDNA一鏈合成：
      

      

      

      

      


      

      將獲取的目的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈。因?yàn)镽NA極易被環(huán)境中存在的RNase降解，在反轉(zhuǎn)錄過程中使用RNase Inhibitor(Yeasen Cat#10603)可以抑制這些酶的活性，保護(hù)RNA不被RNase降解。與此同時(shí)，使用逆轉(zhuǎn)錄酶(Yeasen Cat#11112)將模板RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；逆轉(zhuǎn)錄酶具有依賴RNA的DNA聚合酶活性，能夠以RNA為模板，按5'→3'方向合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，也就是cDNA第一鏈。
      


       
      

      


      

      

      

      

      

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      cDNA二鏈合成：
      

      

      

      

      


      

      反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈cDNA極不穩(wěn)定，需立即在DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成cDNA第二鏈。在二鏈合成時(shí)，RNase H可以除去RNA-DNA雜合鏈中的RNA鏈，配合DNA聚合酶Ⅰ (Yeasen Cat#12903)催化合成cDNA第二鏈。DNA聚合酶Ⅰ 具有5'→3' DNA聚合酶活性，可在模板和引物的作用下，沿5′→3′方向合成與cDNA一鏈互補(bǔ)的序列。
      


       
      


      后續(xù)流程分別為末端修復(fù)、3'端加“A”、接頭連接、PCR富集，這些在DNA文庫構(gòu)建中已有列舉，這里不再多做贅述。需要注意的是，當(dāng)反轉(zhuǎn)錄完成以后，不需要再次打斷核酸片段。
      


       
      


      翌圣生產(chǎn)多種NGS建庫相關(guān)的酶，您可以使用下表，選擇最適合的文庫構(gòu)建產(chǎn)品。
      


       
      


      表1. 翌圣NGS常規(guī)DNA&RNA建庫相關(guān)核心酶 選擇指南
      


      
	
		
      
			
			
      建庫類別
      
			      		
			
			
      定位
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品名稱
      
			      		
			
			
      產(chǎn)品貨號
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      RNA建庫
      
			      		
			
			
      rRNA去除/cDNA二鏈合成
      
			      		
			
			
      
			
      RNase H
      
			
      
			      		
			
			
      12906
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      rRNA去除
      
			      		
			
			
      
			
      Recombinant DNase I
      
			
      
			      		
			
			
      10325
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      cDNA一鏈合成
      
			      		
			
			
      
			
      Murine RNase Inhibitor
      
			
      
			      		
			
			
      10603
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      
			
      Hifair® IV Reverse Transcriptase
      
			
      
			      		
			
			
      11112
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      cDNA二鏈合成
      
			      		
			
			
      
			
      DNA Polymerase I
      
			
      
			      		
			
			
      12903
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      RNA建庫&DNA建庫
      
			      		
			
			
      末端修復(fù)
      
			      		
			
			
      
			
      T4 DNA Polymerase
      
			
      
			      		
			
			
      12901
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      
			
      T4 Polynucleotide Kinase
      
			
      
			      		
			
			
      12902
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      A尾添加
      
			      		
			
			
      
			
      Taq DNA Polymerase
      
			
      
			      		
			
			
      13486
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      接頭連接
      
			      		
			
			
      
			
      Hieff® Novel T4 DNA Ligase
      
			
      
			      		
			
			
      10298
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      PCR富集
      
			      		
			
			
      
			
      Hieff Canace®  Pro High-Fidelity DNA Polymerase
      
			
      
			      		
			
			
      13476
      
			      		
		
      
		
      
			
			
      DNA建庫
      
			      		
			
			
      DNA片段化
      
			      		
			
			
      
			
      Hieff® Smearase Pro
      
			
      
			      		
			
			
      12917
      
			      		
		
      
	      

      


       

      

      

      

      

      

       
      

      


      

      參考文獻(xiàn)
      

      


      

       
      

      

      

      

      

      
 


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      400-6111-883