研究中我們常常會(huì)用到現(xiàn)成的細(xì)胞系/株，一般只需要進(jìn)行細(xì)胞傳代和保種。然而，這些細(xì)胞系常常由于長期體外培養(yǎng)，而丟失原有生物學(xué)特性，對(duì)藥物處理的反應(yīng)差距越來越大。因此，也有越來越多的人選擇原代細(xì)胞。
原代細(xì)胞（Primary cells）：是指直接從機(jī)體取出的組織或細(xì)胞獲得單個(gè)細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞。組織主要指：組織器官、外周血及胚胎等。由于原代細(xì)胞生長緩慢，繁殖一定的代數(shù)停止生長（一般10代以內(nèi)）。
細(xì)胞系第一次傳代培養(yǎng)后，原代培養(yǎng)物即被稱為細(xì)胞系。來自于原代培養(yǎng)的細(xì)胞系壽命有限（即：有限細(xì)胞系），隨著細(xì)胞的傳代，生長能力最強(qiáng)的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢，最終導(dǎo)致細(xì)胞群體在基因型和表型上達(dá)到一定程度的均一性。
細(xì)胞株如果通過克隆或其他方法從培養(yǎng)物中陽性篩選出了細(xì)胞系的亞群，則該細(xì)胞系成 為一個(gè)細(xì)胞株。與親代細(xì)胞系起始時(shí)相比，細(xì)胞株通常會(huì)獲得一些其他的遺傳學(xué)改變。
原代細(xì)胞與細(xì)胞系的區(qū)別如下
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比較 |
原代細(xì)胞 |
細(xì)胞系 |
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增殖能力 |
較弱 |
強(qiáng) |
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繁殖代數(shù) |
一般只能傳10代以內(nèi) |
無限增殖，50代左右 |
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遺傳物質(zhì)完整性 |
遺傳物質(zhì)未改變 |
遺傳物質(zhì)發(fā)生改變 |
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生物特性 |
最接近臨床樣本 |
偏離臨床樣本 |
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培養(yǎng)容易程度 |
比較復(fù)雜 |
簡單，易操作 |
一．這里我們先介紹原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，再介紹現(xiàn)成細(xì)胞系/株的傳代和培養(yǎng)。
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路是取材--分離--培養(yǎng)--鑒定。首先將組織從機(jī)體中取出，經(jīng)胰蛋白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定。在原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的過程中用得比較多的酶類是膠原酶。
膠原酶（Collagenase）是一種蛋白酶，能夠特異性地識(shí)別Pro-X-Gly-Pro序列并切割該序列中性氨基酸（X）和甘氨酸（Gly）之間的肽鍵。膠原酶是唯一一種可以降解具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶，這種膠原纖維廣泛存在結(jié)締組織內(nèi)。
并且針對(duì)不同的組織解離可選用不同的膠原酶類型。目前商業(yè)化提供的細(xì)菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異，分為不同類型：包括膠原酶I型、II型和IV型，可作用于不同類型的組織解離。
膠原酶I（Type I Collagenase）：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性）。通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備。
膠原酶II（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細(xì)胞的制備；
膠原酶III（Type III Collagenase）：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細(xì)胞的制備；
膠原酶IV（Type IV Collagenase）：含有低胰酶活性，通常用于胰島細(xì)胞的制備，或者需要維持受體完整性的細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)。
膠原酶V（Type V Collagenase）：具有更高的膠原酶活性和酪蛋白酶活性，更低的胰酶水平以降低對(duì)細(xì)胞膜蛋白的損傷，適用于胰腺小島細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞的分離。
二．研究如果用到現(xiàn)成的細(xì)胞系或者細(xì)胞株。傳代可以如下操作：
收到細(xì)胞先不開蓋,用酒精將整個(gè)細(xì)胞瓶外壁進(jìn)行消毒，放在培養(yǎng)箱靜置若干小時(shí)后(看細(xì)胞密度而定)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照(建議收細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)基拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細(xì)胞100X，200X各兩張)，排除細(xì)胞本身污染的情況。
①先確定細(xì)胞傳代的時(shí)間：
一般情況下細(xì)胞生長至完全匯合后就應(yīng)該傳代，所有細(xì)胞生長都有一個(gè)要求不宜生長過密(也就是常說的長老了)，但有接觸抑制的細(xì)胞，在匯合前就必須進(jìn)行傳代，這類細(xì)胞一般在密度70-80%就進(jìn)行傳代，否則會(huì)引起細(xì)胞分化。
②確定傳代細(xì)胞類型：
1. 貼壁細(xì)胞的傳代：
去掉原T25培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)基，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;棄PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙明顯，部分細(xì)胞剛開始脫離瓶壁，加4 ml左右完全培養(yǎng)液混勻終止消化，將細(xì)胞小心吹打下來，1000 rpm/min室溫離心5min;棄上清，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶(視細(xì)胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8)，每T25瓶補(bǔ)足培養(yǎng)基至5-6 ml，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。
2.懸浮細(xì)胞傳代：
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000 rpm/min 室溫離心5 min。棄上清，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶(視細(xì)胞密度而定1:4-1:8)，每T25瓶加完全培養(yǎng)液至4-5 ml，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。有些懸浮細(xì)胞趨于成團(tuán)生長，此時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，當(dāng)補(bǔ)液時(shí)，需避免反復(fù)吹打。
3.貼壁細(xì)胞傳代胰酶的使用方法和消化時(shí)間
一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液濃度過高時(shí)，易造成培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片增多，黑渣子增多，常規(guī)細(xì)胞傳代時(shí)建議用0.05%的胰酶進(jìn)行消化，對(duì)于難消化的細(xì)胞可采用0.25%胰酶進(jìn)行消化，細(xì)胞密度過高超過80%時(shí)，采用分步消化法。胰酶儲(chǔ)存在–20°C，解凍在4°C進(jìn)行，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。
胰酶消化的程度是細(xì)胞培養(yǎng)中的一個(gè)關(guān)鍵步驟：消化過度細(xì)胞碎片增多，黑渣子增多，細(xì)胞會(huì)成片脫落，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。
不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性不同，胰酶消化的時(shí)間也會(huì)有差異。胰酶消化時(shí)間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲(chǔ)存時(shí)間，胰酶的儲(chǔ)存溫度，是否反復(fù)凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細(xì)胞的密度有關(guān)。消化對(duì)于新購買的細(xì)胞，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細(xì)去摸索一下消化時(shí)間，可每隔1分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄最佳消化時(shí)間，下一次操作參考之前的記錄來控制時(shí)間即可。
除了以上常用的胰酶和膠原酶。還有一些常用的替代產(chǎn)品。比如Accutase是包含蛋白水解酶和膠原酶活性的一種細(xì)胞消化液，是胰酶/EDTA消化液的完美替換產(chǎn)品。用于從常規(guī)組織培養(yǎng)器皿和粘附培養(yǎng)器皿中消化細(xì)胞。適用于組織解離和細(xì)胞分離，因分離后的細(xì)胞能保持完好的表面抗原，且不含任何動(dòng)物動(dòng)物或者細(xì)菌來源組分，可滿足對(duì)后續(xù)如細(xì)胞表面標(biāo)記、病毒生長分析、流式細(xì)胞分析以及生物反應(yīng)器相關(guān)檢測等多種實(shí)驗(yàn)的要求。
還有Dispase II，中文名分散酶II，一種非特異性金屬蛋白酶，細(xì)胞生物學(xué)中常用于從不同的組織或器官分離單細(xì)胞，并用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)，如原代細(xì)胞的分離，細(xì)胞傳代等。另外，Dispase II還可用于消除懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生的細(xì)胞聚集。與其他細(xì)胞生物學(xué)常用蛋白酶（如胰蛋白酶、膠原酶、鏈霉蛋白酶等）相比，該酶具有以下優(yōu)勢：1）一種快速有效且溫和的細(xì)胞消化酶，對(duì)細(xì)胞損傷小，且能維持細(xì)胞膜完整性；2）來源于細(xì)菌，無支原體或其他動(dòng)物病毒污染；3）穩(wěn)定性強(qiáng)，不受溫度、pH及血清組分的影響；4）可用于多種類型組織和細(xì)胞的分離等。
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