CUT&Tag技術中，利用一抗特異性靶向目標蛋白質(zhì)，之后利用二抗識別一抗來放大信號。隨后，含有pA/G-Tn5的轉(zhuǎn)座酶來識別二抗，最后轉(zhuǎn)座酶在結合位點處切割DNA，留下Tn5的核心序列粘貼在切割的DNA處。最后純化DNA后，利用含有Tn5核心序列的接頭進行PCR擴增最終獲得我們需要的結合DNA的文庫。

 

        那么，一抗、二抗和protein A/G之間的巧妙安排又是何原理呢？

 

       人工制備的一抗，主要是依賴特異性抗原免疫動物而獲得，所以目的蛋白對應抗體能夠識別目的蛋白。而二抗制備，是利用抗體免疫異種動物，由異種動物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的針對于此抗體的免疫蛋白。二抗針對某一特定物種的所有抗體（如IgG、IgM或IgA等）均具有反應性。意思就是，如果使用來源于兔源的一抗，那么選擇抗兔的二抗即可識別該一抗；使用來源于鼠源的一抗，那么使用抗鼠的二抗即可識別該一抗。

 

       CUT&Tag實驗中，推薦使用抗IgG H&L的二抗，它是最常用也是性價比最高的二抗形式。這類抗體和IgG分子的重鏈和輕鏈都可以反應，也可以和其他的免疫球蛋白家族（IgM，IgA，IgD，IgE）和亞家族反應，因為所有的免疫球蛋白都有相同的輕鏈（但是在使用單克隆抗體時，需要選擇與一抗的類別或亞型相匹配的二抗）。同時，還需要要求二抗不帶耦聯(lián)標記（即二抗不能偶聯(lián)任何標記，HRP、FITC等都不行）。

 

       在細菌表面可分泌表達特殊功能蛋白與免疫球蛋白特異結合，主要分為Protein A金黃色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal proteinA, SPA）、Protein G鏈球菌G群的細胞表面蛋白 G（Streptococcal protein G, SPG）和Protein L大消化鏈球菌蛋白L（Peptostreptococcus protein L, PPL），三種均為典型的免疫球蛋白結合蛋白。重組蛋白Protein A由大腸桿菌表達體系獲得，由5個IgG 結合結構域E-D-A-B-C串聯(lián)排列組成，對IgG的Fc片段具有很強的特異性親和力。重組蛋白Protein G從大腸桿菌表達體系中獲得，含有3個IgG 結合區(qū)。為確保 IgG 的最大特異性結合，重組蛋白Protein G 中細胞壁結合區(qū)、細胞膜結合區(qū)和白蛋白結合區(qū)已被去除，減少了交叉反應和非特異性結合。重組蛋白Protein A/G在大腸桿菌中產(chǎn)生，由7個IgG 結合結構域EDABC-C1C3組成，對應于5個Protein A的IgG結合區(qū)和2個Protein G的IgG結構域。重組蛋白Protein A/G 的結合能力比單獨的蛋白A或蛋白G更廣。因此，現(xiàn)在CUT&Tag實驗中，普遍使用Protein A/G-Tn5來進行靶向切割實驗。
 

圖1.Protein A、G親和性

         
       Protein A/G可以與一抗的FC區(qū)域結合，也可以與二抗的FC區(qū)域結合。CUT&Tag實驗中，主要是希望Protein A/G結合二抗達到信號放大。翌圣CUT&Tag試劑盒，將二抗提前與pA/G-Tn5進行孵育，減少了pA/G-Tn5與抗體未識別偶聯(lián)而產(chǎn)生的非特異切割。同時，CUT&Tag實驗時長因此步驟的改變而縮短至6 h。
        這樣巧妙的靶向原理get到了么？ 

 

翌圣CUT&Tag試劑盒優(yōu)勢

 

1.翌圣CUT&Tag試劑盒優(yōu)化了實驗體系，使用protein A/G增加抗體特異識別之外，將二抗與protein A/G提前孵育，減少了非特異切割，同時實驗時長縮短至6 h；

2.添加spike in，讓你的實驗結果更真實，更準確。

 

 

圖2.Spike in校正后，更能反映數(shù)據(jù)的真實性

圖6.Spike in校正后，基因富集更明顯

 

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