核糖核酸（RNA）存在于生物細胞、部分病毒以及類病毒中，種類繁多，功能復(fù)雜，一般按照是否編碼蛋白質(zhì)將其分為編碼RNA和非編碼RNA兩大類。編碼RNA通常指mRNA，非編碼RNA則包括很多種類，可以分為長度大于200nt的非編碼大RNA、長度小于200nt的非編碼小RNA以及特殊的非編碼circRNA。非編碼大RNA包括rRNA，LncRNA。非編碼小RNA包括miRNA、siRNA、piRNA、scRNA等。

此外，非編碼RNA也可以按照表達和功能特性分為細胞生存所必需的管家非編碼RNA和時空特異性表達的調(diào)節(jié)非編碼RNA。

 

 
在近些年國自然中標項目中，以非編碼RNA為研究主線的主要是miRNA、circRNA、LncRNA和CeRNA，其中CeRNA并不是一種新的RNA分子，只是一種新發(fā)現(xiàn)的基因表達調(diào)節(jié)機制。相較于常見的mRNA反轉(zhuǎn)錄不同，上述RNA進行反轉(zhuǎn)錄時有著各自的特點與要求。

 

miRNA反轉(zhuǎn)錄

成熟的miRNA的長度只有20nt左右，通常正向引物就會覆蓋其全長甚至?xí)卸嘤嗖糠?，反向引物就無處安置了。目前市面上解決方案就是在反轉(zhuǎn)錄時設(shè)法增加反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度。常見的方法有加尾法和莖環(huán)法。

加尾法利用PolyA 聚合酶為成熟的miRNA加上Poly(A)尾，以帶有通用序列的Oligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄引物，合成加長的miRNA對應(yīng)cDNA第一鏈。莖環(huán)法以折疊為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的通用序列作為引物合成加長的miRNA對應(yīng)cDNA第一鏈，后續(xù)擴增過程中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)在適宜的溫度下會被打開，和相關(guān)擴增引物結(jié)合。

圖. 加尾法合成cDNA

圖.莖環(huán)法合成cDNA
 

circRNA反轉(zhuǎn)錄

circRNA是通過特殊選擇性剪切產(chǎn)生的封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)非編碼RNA。不受RNA外切酶的影響，比線性RNA更穩(wěn)定。由于circRNA沒有3‘ poly（A）尾，一般不使用oligo dT作為反轉(zhuǎn)引物，可選用隨機引物（random primers N6或N9均可）進行反轉(zhuǎn)錄。

但需要注意的是，通常提取的RNA中含有大量線性RNA，傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄酶難以區(qū)分環(huán)狀和線性RNA，建議在進行circRNA反轉(zhuǎn)錄時，事先用RNA酶R處理線性RNA以使circRNA得到富集，從而減少錯誤或偏倚發(fā)生。

圖.circRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
 

LncRNA反轉(zhuǎn)錄

LncRNA是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，經(jīng)過剪接，有些具有poly（A）尾巴，有些則沒有poly（A）尾巴，表達量相對較低。研究表明，LncRNA在劑量補償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮著重要的作用。在進行反轉(zhuǎn)錄時，建議選用隨機引物（random primers N6或N9均可）或基因特異性引物進行反轉(zhuǎn)錄。
 

圖.LncRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
 

產(chǎn)品推薦

翌圣miRNA加尾法反轉(zhuǎn)定量組合（11148ES&11171ES)

11148ES-Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

試劑盒采用加尾法來進行miRNA第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)品中的2×Hifair^® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的所有原料和引物，并經(jīng)過精心優(yōu)化，可保證miRNA 3‘末端的Poly(A)修飾過程和反轉(zhuǎn)錄過程同時高效進行。

11171ES -Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

 

專門為miRNA定量檢測而研發(fā)的新一代預(yù)混形式的熒光定量PCR檢測試劑，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調(diào)整ROX的濃度，只需在配制反應(yīng)體系時加入引物和模板即可進行擴增。DNA 聚合酶采用化學(xué)修飾的熱啟動聚合酶，配合特殊的Buffer體系，使反應(yīng)特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內(nèi)進行準確定量。

 

產(chǎn)品性能

可兼容全平臺qPCR儀器

圖. 以293T細胞的Total RNA為模板，用Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋10倍后，用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6內(nèi)參基因。

 

檢出率高，最高可達10 pg

圖. 以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T細胞Total RNA(b)為模板，分別稀釋成以下梯度：60拷貝到60⁶拷貝（6個梯度）和10 pg-100 ng(5個梯度)，用Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)檢測hsa-miR-let-7e-5p基因表達情況。

 

高特異性，能區(qū)分同家族miRNA間單堿基差異

圖. 人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。每個Let-7亞型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以不用的引物，用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別擴增這些miRNA，利用公式2^-ΔCTx 100%計算匹配率。結(jié)果顯示，可有效區(qū)分密切相關(guān)的亞型家族成員。

 

擴增效率出色

圖. 以人293T細胞和鼠源肝臟Total RNA為模板，擴增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。結(jié)果顯示，與同類產(chǎn)品相比，Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反應(yīng)體系，具有優(yōu)異的表現(xiàn)。

 

穩(wěn)定性優(yōu)秀，在 37℃穩(wěn)定7天或凍融50次或配置體系在25℃保留48 h，效果依舊穩(wěn)定

 

圖. 以293T細胞Total RNA為模板用Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 進行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋10倍，用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表達情況?！鰿t<0.5。 

 

翌圣高效靈活反轉(zhuǎn)錄試劑盒（11139ES)

11139ES-Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

該試劑盒基于Hifair^® III Reverse Transcriptase而開發(fā)。該酶cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄?？筛鶕?jù)研究的RNA類型，靈活選擇所需引物進行反轉(zhuǎn)錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的反轉(zhuǎn)錄。Hifair^® III Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可合成長達19.8 kb的cDNA。
 

優(yōu)越的延伸性能，可合成19.8kb的cDNA

圖. 以500ng 293T細胞的總RNA為模板，oligodT為引物，使用11139ES合cDNA。取1μL cDNA為模板，使用Hieff^® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)擴增DY1C1N1基因（19.8kb）的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.

 

線性檢測范圍廣，Total RNA 10pg-5μg

圖.以10pg-5μg的293T細胞的總RNA為模板，使用11139ES合成cDNA。取1μL cDNA為模板，使用Hieff UNICON^® Power qPCR 預(yù)混液 (Cat NO.11195ES)擴增基因。 

 

相關(guān)產(chǎn)品推薦

適用RNA類型	實驗步驟	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號
miRNA（加尾法）	反轉(zhuǎn)錄	Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(加 A 法)	11148ES
miRNA（莖環(huán)法）	定量PCR	Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(加A法)	11171ES
	定量PCR	Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(莖環(huán)法)	11170ES
mRNA、circRNA、LncRNA、其他小RNA	反轉(zhuǎn)錄	Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)	11139ES
	定量PCR	Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix	11184ES