產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix是2×實時定量PCR擴增的預(yù)溶液，具有高靈敏度和高特異性的特點，顏色為藍(lán)色，具有加樣示蹤的作用。核心組分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗體法熱啟動，可以有效抑制樣品準(zhǔn)備過程中引物退火導(dǎo)致的非特異性擴增。同時配方添加了提升PCR反應(yīng)擴增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因擴增的促進(jìn)因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的線性關(guān)系。
本產(chǎn)品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調(diào)整ROX的濃度，只需在配制反應(yīng)體系時加入引物和模板即可進(jìn)行擴增。
運輸和保存方式
冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。
本品避免反復(fù)凍融。產(chǎn)品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應(yīng)體系時需避免強光照射。
注意事項
1. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號：11141ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
2. 解凍后Master Mix可能出現(xiàn)絮狀或白色沉淀，手握緩慢溶解并上下輕柔顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
4. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
反應(yīng)體系
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組分 |
體積（μL） |
體積（μL） |
終濃度 |
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Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix |
25 |
10 |
1× |
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Forward Primer (10 μM) |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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Reverse Primer (10 μM) |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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模板DNA |
X |
X |
- |
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無菌超純水 |
to 50 |
to 20 |
- |
【注】：使用前務(wù)必充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。
a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進(jìn)行調(diào)整。
b) 模板濃度：如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過qPCR反應(yīng)總體積的1/10。
c) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的Ct值在20-30個循環(huán)為好。
d) 反應(yīng)體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復(fù)性。
e) 體系配制：請于超凈工作臺內(nèi)配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應(yīng)管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
標(biāo)準(zhǔn)程序 快速程序
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
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預(yù)變性 |
95℃ |
2 min |
1 |
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預(yù)變性 |
95℃ |
30 sec |
1 |
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變性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
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變性 |
95℃ |
3 sec |
40 |
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退火/延伸 |
60℃ |
30 sec★ |
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退火/延伸 |
60℃ |
20 sec★ |
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熔解曲線階段 |
儀器默認(rèn)設(shè)置 |
1 |
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熔解曲線階段 |
儀器默認(rèn)設(shè)置 |
1 |
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【注】 快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)基因可嘗試標(biāo)準(zhǔn)程序。
a) 退火溫度和時間：請根據(jù)引物和目的基因的長度進(jìn)行調(diào)整。
b) 熒光信號采集（★）：請勿忘記打開熒光信號采集，按照儀器使用說明書要求進(jìn)行實驗程序設(shè)置，幾種常見儀器的時間設(shè)定如下：
20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast
31 sec：Applied Biosystems 7300
32 sec：Applied Biosystems 7500
c) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序。
結(jié)果分析
定量實驗至少需要三個生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后需要確認(rèn)擴增曲線及熔解曲線。
1) 擴增曲線：標(biāo)準(zhǔn)擴增曲線為S型。
Ct值落在20-30之間時，定量分析最準(zhǔn)確；
Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進(jìn)行實驗；
Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應(yīng)體系的體積，以提高擴增效率，保證結(jié)果分析的準(zhǔn)確性；
Ct值大于35時，檢測結(jié)果無法定量分析基因的表達(dá)量，但可用于定性分析。
2) 熔解曲線：
熔解曲線單峰，表明反應(yīng)特異性好可以進(jìn)行定量結(jié)果分析；若熔解曲線出現(xiàn)雙峰或者多峰，則不能進(jìn)行定量分析。
熔解曲線出現(xiàn)雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標(biāo)峰是引物二聚體還是非特異性擴增。
如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設(shè)計擴增效率高的引物。
如果是非特異性擴增，請?zhí)岣咄嘶饻囟?，或者重新設(shè)計更高特異性的引物。
引物設(shè)計指南
1. 推薦引物長度25 bp左右。擴增產(chǎn)物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內(nèi)選擇。
2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。
3. 引物堿基分布要均勻，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。
4. 引物內(nèi)部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個堿基以上的互補序列。
5. 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進(jìn)行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。
6. 設(shè)計完成的引物需要進(jìn)行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。
適用機型
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus; 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;
Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;
Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;
Thermo Scientific: PikoReal Cycler;
Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.
HB221205
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